桑椹酒香氣成分的HS－SPME－GC－MS分析

衛(wèi)春會 邊名鴻 黃治國

羅惠波1，2 王 毅1 楊曉東1

（1.四川理工學院生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000）

桑椹酒是一種新興的果酒，是以新鮮桑椹、干桑椹或桑椹汁為原料，利用酵母經過酒精發(fā)酵、陳釀等過程釀制而成，具有典型的桑椹香味和酒香，口味爽口。經發(fā)酵的桑椹酒營養(yǎng)豐富，而且具有許多保健功能。飲用后，不但可以改善女性手腳冰冷的毛病，更有補血、強身、益肝、補腎、明目等功效，可稱之為水果酒中的極品［1，2］。

頂空固相微萃取是一種全新概念的樣品預處理濃縮技術，它克服了傳統(tǒng)提取方法的缺陷，具有簡便、靈敏度高、重現性及線性好、樣品處理時間短、分析樣品用量少、無需有機溶劑和綠色環(huán)保等優(yōu)點［3－5］。頂空固相微萃取－氣質聯(lián)用法（HS－SPME－GC－MS）已廣泛應用于櫻桃酒、葡萄酒、蘋果酒、黃酒等酒類的揮發(fā)成分的研究［6－9］，但對桑椹發(fā)酵型果酒香氣成分頂空固相微萃取的方法進行優(yōu)化尚未見報道。本試驗對頂空固相微萃取法提取桑椹果酒中香氣成分的條件進行了優(yōu)化，使用氣質聯(lián)用儀進行分析，為進一步完善桑椹酒的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

桑椹酒：釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室提供。

1.2 主要儀器與設備

氣相色譜－質譜聯(lián)用儀：6890N－5975B型，美國Agilent科技有限公司；

頂空固相微萃取、SPME手動進樣柄和萃取頭50／30μmDVB／CAR／PDMS：上海安譜科學儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：HJ－8B型，金潭市正基儀器有限公司。

1.3 試驗方法

參照文獻［10］，于15mL樣品瓶中加入桑椹酒、NaCl和磁力轉子，蓋好瓶蓋后，迅速置于磁力攪拌加熱臺上，轉速為200r／min條件下，加熱攪拌。然后將已經熱解析過的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取頭距離液面1cm處，然后將已吸附香味物質的萃取頭插入氣相色譜進樣口，230℃條件下解析3min。每個樣品重復3次。

1.3.1 萃取條件的優(yōu)化

（1）NaCl濃度的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶內，加入不同質量的 NaCl（0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30g／mL），萃取溫度40 ℃，萃取和平衡時間均為30min。萃取完成后用于GC－MS分析。

（2）萃取溫度的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶內，按照0.2g／mL量加入NaCl，萃取和平衡時間均為30min，萃取溫度分別為20，25，30，35，40，45，50℃。萃取完成后用于GC－MS分析。

（3）萃取時間的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶內，按照0.2g／mL量加入 NaCl，萃取溫度40℃，平衡時間30min，萃取時間分別為5，10，20，30，40，50，60min。萃取完成后用于GC－MS分析。

（4）平衡時間的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶內，按照0.2g／mL量加入 NaCl，萃取溫度40℃，萃取時間30min，平衡時間分別為5，10，20，30，40，50，60min。萃取完成后用于GC－MS分析。

1.3.2 氣相色譜－質譜條件

（1）色譜條件：DB－WAX 60.0m×0.25mm×0.25μm毛細管色譜柱；進樣口溫度230℃；分流比30∶1；程序升溫：60℃保持3min，以5℃／min升到200℃，再以10℃／min升到230℃保持1min；載氣：99.999%氦氣，載氣流速：1mL／min。

（2）質譜條件：電離電壓70eV，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，電離方式為EI，質量掃描范圍為20～500amu，溶劑延遲3min。

1.3.3 判斷標準 試驗采用氣相色譜－質譜聯(lián)用儀對桑椹酒進行分析，以出峰個數、峰面積以及香味物質的數目3個評價指標進行綜合分析，同時與NIST譜庫對比，對物質進行定性。

2 結果與分析

2.1 單因素條件優(yōu)化結果與分析

2.1.1 NaCl濃度 本試驗研究了NaCl濃度對SPME萃取量的影響，對NaCl濃度進行了優(yōu)化。結果見圖1。

由圖1可知，不同NaCl濃度萃取得到的香味物質的種類分別為44，43，47，55，56，42，39。在低濃度的 NaCl條件下，鹽析可以提高萃取香味物質的種類，隨著NaCl濃度的增加，萃取效率逐漸降低。相比較而言，NaCl濃度對醇類物質的影響比酯類和酸類要明顯大一些。而鹽析可提高某幾種物質的信號強度，但對其它化合物的檢測靈敏度降低。同時，鹽析作用對于極性組分的影響要遠大于非極性組分，所以不同組分對于添加鹽的用量存在差異。根據試驗結果確定在NaCl濃度為0.2g／mL時，桑椹酒萃取效果最好。

圖1 NaCl濃度對萃取量的影響Figure 1 Effect of sodium chloride concentration on extractable amount

2.1.2 萃取溫度 試驗研究了萃取溫度對SPME萃取量的影響，對萃取溫度進行了優(yōu)化。結果見圖2。

圖2 萃取溫度對萃取量的影響Figure 12 Effect of extraction temperature on extractable amount

由圖2可知，隨著萃取溫度的增加，出峰的個數、總峰面積和香味物質種類都隨著萃取溫度的增加而增加；但在40℃后，出峰個數、總峰面積以及香味物質種類都隨著溫度的變化有較明顯的減少。由于在溫度升高時較多的分析物會從基質中逸出進入液面的上方，增加了總峰面積、出峰個數及香味物質的萃取效率，但超過一定溫度萃取量開始降低。下降的原因有可能是因為競爭性的結果，乙醇吸附量會大量的積累，從而降低了其它香味成分的吸附。因此，最終選擇40℃為最佳萃取溫度。

2.1.3 萃取時間 本試驗研究了萃取時間對SPME萃取量的影響，對萃取時間進行了優(yōu)化。結果見圖3。

圖3 萃取時間對萃取量的影響Figure 3 Effect of time on extractable amount

萃取所需要的時間，由待測組分的分配系數、物質擴散速率、樣品基質、樣品體積等因素決定。由圖3可知，萃取過程均在剛開始時吸附量增加迅速，出現一轉折點后上升緩慢，有的甚至出現下降。通過色譜分析可知，30min之前，隨著萃取時間的增加，總峰面積和出峰個數都在增加，在30min出現轉折點，總峰面積和出峰個數都隨著萃取時間的延長而降低，較明顯變化的香味物質是酯類、醇類和酸類。由此可見，在萃取時間為30min時，萃取量達到的效果最佳，故選擇30min為最佳萃取時間。

2.1.4 平衡時間 由圖4可知，隨著平衡時間的增加，出峰個數和香味物質的種類都有明顯的增加，而總峰面積先是變化不明顯，然后明顯增加；在30min后，隨著平衡時間的繼續(xù)增加，總峰面積、出峰個數以及香味物質的種類都有明顯的降低。據分析可知，在萃取的過程中，形成氣－液兩相，在平衡的過程中，隨著時間的增加，分配系數發(fā)生改變，萃取頭吸取到的物質狀態(tài)發(fā)生變化，從而影響萃取量。故選擇30min為最佳平衡時間。

2.2 桑椹酒香味物質的定性

由單因素試驗結果可知：最佳萃取條件為NaCl濃度0.2g／mL，萃取溫度40 ℃，平衡時間30min，萃取時間30min。根據最佳萃取條件，利用HS－SPME與GC－MS聯(lián)用法對桑椹酒香味物質進行定性分析。結果見圖5和表1。

圖4 平衡時間對萃取量的影響Figure 4 Effect of equilibrium time on extractable amount

圖5 桑椹酒香味物質成分的總離子流圖Figure 5 GC－MS total ion chromatogram of aroma compounds in mulberry wine

由圖5和表1可知，桑椹酒通過固相微萃取能夠較好的分離其中的香味成分。試驗共分離出54種香味成分，其中酯類19種、醇類17種、酸類4種、其它14種。其中酯類、醇類、酸類分別占香味成分總數的49.68%，19.65%，6.52%。桑椹酒的主體香味含量排前12種的依次為棕櫚酸乙酯、乙縮醛、苯乙醇、乙酸異戊酯、丁內酯、辛酸乙酯、乙酸、異丁醇、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丙醇。這12種物質基本構成了桑椹酒的主體香味成分。梁貴秋等［11］對桑椹果酒揮發(fā)性成分的GC／MS分析結果與本研究的結果有所不同，可能是因為桑椹品種、釀造所用菌株、釀造工藝以及萃取條件不同造成的。陳娟等［12］采用溶劑萃取結合GC－MS的方法對不同品種桑椹的香氣成分進行分析，得知桑椹原料中主要包括高級脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、芳香醇、脂肪醛以及脂肪酮等香氣成分，為本試驗桑椹酒的研究提供了基礎數據依據。

表1 HS－SPME－GC－MS法分析桑椹酒中香味成分的結果Table 1 HS－SPME－GC－MS analytical results of aromatic compounds in mulberry wine

3 結論

本試驗采用頂空固相微萃取和氣相色譜質譜聯(lián)用的方法檢測分析了桑椹酒中的香味成分，對固相微萃取桑椹酒中香味成分的條件進行了優(yōu)化，得到最佳萃取條件為NaCl濃度0.2g／mL，萃取溫度40℃，萃取時間30min，平衡時間30min。在最佳萃取條件下，通過氣質聯(lián)用法共分析出54種香味成分，其中包括酯類19種、醇類17種、酸類4種、其它14種；其中含量最多的是酯類和醇類，分別占總的香味成分的49.68%和19.65%，其中含量排前十二的依次為棕櫚酸乙酯、乙縮醛、苯乙醇、乙酸異戊酯、丁內酯、辛酸乙酯、乙酸、異丁醇、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丙醇。這12種物質為桑椹酒的主要香味成分，構成桑椹酒的特有品質。

本研究從NaCl濃度、萃取溫度和時間三方面對桑椹酒香味物質的萃取條件進行了優(yōu)化，也對桑椹酒中的香味物質做了定性分析，但影響萃取的因素是多方面的，也是綜合性的，同時，香味物質的提取和分析方法也是多樣的，因此，后期有待深入研究，對進一步解析桑椹酒的香味成分具有十分積極的意義。

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