大紅袍與紅茶對腸道菌群失衡的作用研究

金莉莎 劉仲華， 黃建安 蔡淑嫻

（1.湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128）

古醫書中早有記載茶葉對腸道疾病的預防和治療作用［1］。現代茶醫學研究［2，3］表明，茶葉具有改善腸道菌群、增強機體免疫力等多種保健養生功效。盡管不同茶類可能具有同一保健養生功能，但由于原料和加工工藝不同，品質風味與內含物質組成不同，其產生某一作用的效能及作用途徑可能存在一定差異。大紅袍是閩北烏龍茶的極品，屬于半發酵茶，紅茶是多酚氧化酶主導下的全發酵茶，長期的民間飲用實踐表明，大紅袍和工夫紅茶都有一定的調理腸胃作用，但對它們的作用效果及作用途徑尚缺乏深入的研究［4］。本試驗采用大紅袍和紅茶提取凍干粉飼喂試驗小鼠，然后利用抗生素類藥物鹽酸林可霉素誘導試驗小鼠腸道菌群失衡及機體免疫功能紊亂，探討茶葉對腸道菌群及機體免疫功能的調節效果，為大紅袍和紅茶的保健養生消費提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器與試劑

全自動生化分析儀：LABOSPECT003型，日本日立公司；

臺式冷凍離心機：MIKRO 22R型，德國Hettich公司；

石蠟切片機：Leica RM2235型，德國徠卡公司；

生物顯微鏡：Leica DM2000型，德國徠卡公司；

酶 標 儀：Thermo Scientific Varioskan Flash 型，美 國Thermo公司；

冷凍干燥機：Modulyod－230型，美國 Thermo Fisher scientific公司；

旋轉濃縮蒸發儀：BUCHI R－200型，瑞士BUCHI公司；

血清總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）測定試劑盒：上海科華生物科技有限公司；

血清IgG ELISA測定試劑盒：美國Cusabio公司；

鹽酸林可霉素：300mg／mL，批號：H41020128，河南天方藥業股份有限公司。

1.1.2 培養基

BBL培養基（培養雙歧桿菌）、MRS基礎培養基（培養乳桿菌）、EC瓊脂培養基（培養腸球菌）及EMB培養基（培養腸桿菌）：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.3 供試材料

大紅袍：老記大紅袍，中國老記茶業集團；

紅茶：文新信陽紅（條形工夫紅茶），河南省信陽文新茶葉有限公司。

1.1.4 試驗動物及基礎飼料

昆明小鼠：SPF級，雄性，體重20～25g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。試驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2011－0003。

動物基礎飼料：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模

（1）茶葉水提物的制備：試驗時，沸水浸泡30min（1∶10（m∶V）茶水比），冷卻后過濾，濾液用旋轉蒸發儀濃縮后于冷凍干燥機中凍干。收集凍干茶粉，密封保存備用。兩種茶葉水提物的主要品質成分含量見表1。

表1 茶葉水提物的主要品質成分含量Table 1 The content of main components of different tea extracts

（2）劑量配置：試驗所選高、低劑量濃度分別為300，75mg／kg。每只小鼠的灌胃體積為0.3mL／d。

（3）試驗動物組別設計：所有小鼠自由攝食、飲水，飼喂基礎飼料，環境相對濕度控制在45%～60%，溫度（20±5）℃。喂養3d讓其適應飼喂方式與環境，3d后隨機分為6組，每組10只小鼠，分別為正常對照組、模型對照組、大紅袍低劑量組、大紅袍高劑量組、紅茶低劑量組、紅茶高劑量組。開始8d，正常對照組和模型對照組灌胃生理鹽水，其他4組分別灌胃相應的受試樣品。第9天，茶葉4組除灌胃相應的受試物外，與模型組一起灌胃300mg／mL鹽酸林可霉素，0.3mL每次，每天2次，正常對照組則灌胃等量生理鹽水，連續5d，于最后1次給受試物24h后，無菌采集小鼠鮮糞便檢測腸道菌群數量。試驗結束后，處死小鼠。

1.2.2 腸道菌群檢測 根據文獻［5］，修改如下：用已滅菌的瓶子無菌采集小鼠鮮糞便，加無菌水遞10倍稀釋至10－8，在超凈工作臺上取1mL分別接種在各類培養基上，EC培養基、EMB培養基放入需氧培養箱37℃培養，BBL培養基、MRS培養基放入厭氧培養箱37℃培養。菌落長出后計數并計算每克糞便中各菌群的菌落形成單位（CFU／g）。

1.2.3 脾指數測定 小鼠處死前稱量體重，處死后分離脾臟，稱量脾臟重量。按式（1）計算脾指數。

1.2.4 血清中各指標的測定 血清總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）在全自動生化分析儀上進行檢測，根據總蛋白、白蛋白的含量計算出血清球蛋白的含量。血清IgG含量按照ELISA試劑盒要求進行測定。

1.2.5 病理學檢測 取小鼠結腸組織，HE染色，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 小鼠腸道菌群失調模型驗證

模型組灌胃鹽酸林可霉素5d后，小鼠行動緩慢、背毛豎起并出現腹瀉的癥狀，立即采取鮮糞便進行菌落計數及統計分析（表2）。結果表明，模型對照組的腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌與正常對照組相比，有不同程度的減少，且存在著極顯著差異（P＜0.01）。解剖正常對照組和模型對照組小鼠，發現模型對照組小鼠盲腸充血腫脹，腸壁變薄，內容物呈水狀，上述結果證實通過灌胃鹽酸林可霉素，成功建立了菌群失衡模型。

2.2 大紅袍和紅茶對鹽酸林可霉素誘導小鼠腸道菌群失衡的影響

在小鼠灌胃鹽酸林可霉素5d后，大紅袍2個劑量組的菌群菌量與模型對照組小鼠相比存在極顯著差異（P＜0.01），接近正常對照組的水平；紅茶只有在高劑量時，腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌菌群菌量與模型對照組小鼠相比有顯著差異（P＜0.05）。由此可見，大紅袍和紅茶在預防抗生素所致的腸道菌群紊亂方面具有一定的作用，且大紅袍的預防效果優于紅茶（表2）。

2.3 大紅袍和紅茶對試驗小鼠脾指數、球蛋白和IgG的影響

脾指數、球蛋白含量和免疫球蛋白IgG含量是反映小鼠機體免疫功能的重要指標。由表3可知，大紅袍2個劑量組和紅茶2個劑量組的脾指數均高于模型對照組，但無統計學上的顯著差異。大紅袍2個劑量組和紅茶2個劑量組的球蛋白含量與模型對照組相比均明顯增加，且大紅袍、紅茶低劑量組與模型對照組有顯著差異（P＜0.05），大紅袍、紅茶高劑量組與模型對照組存在極顯著差異（P＜0.01）。大紅袍2個劑量組和紅茶2個劑量組的免疫球蛋白IgG含量均明顯高于模型組，且均存在極顯著差異（P＜0.01）。

表2 小鼠經鹽酸林可霉素灌胃后腸道菌群的變化?Table 2 Change of intestinal flora in mice after feeding lincomycin hydrochloride ／（lg N·g－1）

表3 小鼠經鹽酸林可霉素灌胃后脾指數、球蛋白和IgG的變化?Table 3 Change of spleen index，globulin and IgG in mice after feeding lincomycin hydrochloride

2.4 各組小鼠結腸切片的病理觀察

由圖1可知，正常小鼠結腸組織表面光滑，小腸絨毛粗大，腸黏膜上皮完整；模型組小鼠小腸絨毛充血、水腫，腸絨毛變平、變短、萎縮、倒伏，小腸絨毛輪廓不清，部分腺上皮脫落，可見炎性細胞浸潤；大紅袍低劑量組小鼠腸黏膜較完整，

圖1 各組小鼠結腸切片圖（100×）Figure 1 Colon section of mice in different groups（100×）

小腸絨毛變短，可見少量炎性細胞浸潤；大紅袍高劑量組小鼠結腸組織表面光滑，潰瘍面恢復較好，小腸絨毛變長；紅茶低劑量組小鼠腸絨毛變短、萎縮、輪廓不清，可見炎性細胞浸潤；紅茶高劑量組小鼠腸黏膜較完整，腸絨毛輪廓較清晰。從小鼠結腸切片可以清晰地看出，大紅袍和紅茶對抗生素藥物鹽酸林可霉素誘導的小鼠結腸組織病變均具有一定的預防作用，且高劑量較低劑量效果明顯，同一劑量條件下，大紅袍比紅茶的效果要好一些。

3 討論

石梅等［6］用抗生素混合液灌胃小鼠連續3d，小鼠腸道菌群失衡，脾指數、淋巴細胞轉化率及血清免疫球蛋白IgG含量等均明顯下降。劉崇海等［7］給小鼠口服抗生素后給予白色念珠菌，使其腸道菌群失衡后發現PHA誘導的淋巴細胞轉化率、脾指數以及TLR2和TLR4基因表達水平與正常組相比均降低。這些均表明抗生素誘導的動物腸道菌群失衡可致機體免疫功能紊亂或低下。

本試驗采用鹽酸林可霉素誘導小鼠腸道菌群失衡，模型組小鼠表現出腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌菌量大幅度減少，脾指數、血清球蛋白含量、免疫球蛋白IgG含量均下降，腸絨毛損傷嚴重。然而，使用大紅袍和紅茶提取物飼喂預防后，尤其是高劑量使用后，這種由鹽酸林可霉素引起的小鼠腸道菌落失衡、機體免疫功能紊亂及結腸組織病變等現象得到明顯抑制。這說明在使用抗生素的同時飲用大紅袍和紅茶，對預防腸道菌群失衡和機體免疫功能紊亂方面具有一定的作用，且在等劑量條件下大紅袍的效果優于紅茶。從表1大紅袍和紅茶水提物的主要品質成分含量中，可以看出大紅袍的茶多酚和茶多糖含量均高于紅茶，且有研究［8］表明，茶多酚能提高小鼠腸道中的雙歧桿菌含量，所以大紅袍預防腸道菌群失衡的效果優于紅茶可能與這些成分有關，但其作用機理還需進行進一步的研究。

1 陳宗懋.茶對人體腸道免疫功能的影響［J］.中國茶葉，1995（5）：26～27.

2 Wolfram S，Wang Y，Thieleeke F.Anti－obesity effects of green tea：From bedside to bench［J］.Mol Nutr Food Res，2006，50（2）：176～187.

3 Kao Y H，Chang H，Lee M J.Tea，obesity，and diabetes［J］.Mol Nutr Food Res，2006，50（21）：188～210.

4 徐仲溪，王坤波.茶多糖化學及生物活性研究［J］.茶葉科學，2004，24（2）：75～81.

5 張燕，羅予.加味四君子湯對小鼠腸道免疫功能調整作用的研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21（5）：1 181～1 183.

6 石梅，彭廣能，鐘志軍，等.思密達對實驗性小鼠腸道菌群及免疫功能影響的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫，2007（11）：88～89.

7 劉崇海，楊錫強，劉恩梅，等.抗生素誘導小鼠腸道菌群失調對免疫功能和Toll樣受體2、4基因表達的影響［J］.重慶醫科大學學報，2007，32（8）：839～842.

8 王瑋，曾本華，李桂花，等.茶多酚對apoE－／－－小鼠脂類代謝和腸道雙歧桿菌的影響［J］.食品與機械，2012，28（4）：106～109.