四溴雙酚A在鯽魚不同器官中的分布、富集及病理研究

楊蘇文,徐范范,趙明東 (中國環(huán)境科學研究院湖泊生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室,北京 100012)

四溴雙酚 A(TBBPA)是世界范圍內(nèi)被廣泛應用的溴代阻燃劑,主要通過塑料和電子產(chǎn)品的制造與加工處置和循環(huán)利用過程進入環(huán)境[1],目前已在土壤、水體、沉積物和大氣等環(huán)境介質(zhì)以及人體內(nèi)檢測到[2-8].TBBPA的水環(huán)境暴露水平日益升高,對水生生物具有潛在毒害影響.

環(huán)境污染物對水生生物的毒性效應是進行毒性效應研究及生態(tài)風險評價的基礎.鯽魚是分布于我國大部分地區(qū)的經(jīng)濟性魚類,為本土物種,對TBBPA毒性效應及生態(tài)系統(tǒng)風險評價研究具有廣泛代表性,目前已被普遍應用于生態(tài)毒理學方面的研究,但有關(guān) TBBPA在魚體中組織分布和富集效應的研究還較鮮見[9].因此本研究以鯽魚(Carassius auratus)為受試生物,通過分布動力學定量地確定魚體各組織器官中 TBBPA含量,研究TBBPA在魚體肝臟、腎臟、鰓和肌肉中的吸收與富集效應,結(jié)合不同暴露時間鯽魚肝臟、腎臟、鰓、性腺的組織病理學,以期初步確定TBBPA在鯽魚體內(nèi)的分布特征及作用靶器官,為闡明TBBPA的毒性效應機制機理及生態(tài)風險評價提供參考.

1 材料與方法

1.1 組織分布與生物富集實驗方法

1.1.1 實驗動物 鯽魚(Carassius auratus)購于北京市通州區(qū)花鳥魚蟲市場,體長為(6.95±1.05)cm,體重為(5.90±0.80)g,在室內(nèi)馴化 2 周,死亡率穩(wěn)定在 1%～2%以下,試驗用水為自來水,室內(nèi)靜置 48h 去氯,溫度(25±1)℃,光周期為 14h:10h,溶液 氧 為 (7.5±0.5)mg/L,pH 值 (7.8±0.2),水 硬 度(109±10)mg/L (以 CaCO3計).

1.1.2 實驗方法 TBBPA工業(yè)品(97%)為美國Alfa Aesar公司進口,采用乙醇作為助溶劑配制50mg/mL的儲備液備用.將360條鯽魚隨機放入盛有60L處理液的玻璃缸內(nèi),每缸30條魚,根據(jù)TBBPA對鯽魚的 96h-LC50值[10]及慢性毒性實驗濃度設置的一般規(guī)則[11-12],設定亞致死處理濃度為 0.5mg/L和2.0mg/L,24h更換一次相同濃度的處理液,并以助溶劑乙醇處理的魚作對照,實驗期間每天喂食1次.實驗周期為32d[13].在暴露時間分別為2,4,8,16,32d取樣,進行前處理后(方法參見文獻[9]),HPLC測定肝臟、腎臟、鰓和肌肉中TBBPA含量,并利用公式計算生物富集系數(shù)(公式見2.2節(jié)).

1.2 組織病理切片實驗方法

1.2.1 實驗儀器 Thermo Shandon Excelsior組織處理機,TKY-BMB,湖北泰康醫(yī)療設備有限公司石蠟包埋機,Leica RM2235型切片機,Thermo Shandon Varistain Gemini 全自動染片機,Thermo Shandon Consul 全自動封片機,德高 Zeiss Imager. M1顯微鏡.

1.2.2 實驗方法 暴露實驗第2,4,8,16,32d每次隨機取10尾鯽魚.取鯽魚肝臟、腎臟、鰓、精巢和卵巢組織放置于4%甲醛溶液中固定24h,固定后的組織在清水沖洗15h以上,經(jīng)50%～100%各級乙醇梯度脫水,2:1、1:1、1:2的二甲苯/石蠟和全石蠟逐級滲透,最后包埋于切片用石蠟中,制成組織蠟塊.將埋有組織的蠟塊固定在切片機上,7μm 切片,用明膠甘油將組織薄片貼于載玻片上,37℃烘干.組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟和70%～ 100%各級乙醇梯度脫水,用蘇木精染色,經(jīng)過1%鹽酸分化和0.1%氨水顯色后,再經(jīng)50%～90%各級乙醇梯度脫水,用0.5%酒精伊紅(95%酒精配制)染色,95%和 100%的乙醇進一步脫水,最后用中性樹膠封片.顯微鏡下觀測并拍照,采用Photoshop軟件進行圖像處理和分析.觀察各染毒組中甲狀腺濾泡上皮厚度、細胞肥大和增生、膠質(zhì)減少和濾泡上皮細胞周圍血管增生等病變現(xiàn)象.

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用origin 7.5和sigma Plot 10.0處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 TBBPA在鯽魚不同器官的組織分布

由圖1可見,鯽魚肝臟組織在第8d出現(xiàn)吸收高峰,隨后下降,其中0.5mg/L暴露組32d TBBPA的濃度低于第2d的濃度,而2.0mg/L暴露組32d后的肝組織濃度為第 2d濃度的 4.1倍,達到146.61ng/g.0.5mg/L組腎臟組織在4d達到最大值,隨后逐步降低,32d時濃度稍高于第 2d,為對照的4.5倍.2.0mg/L組在第8d達到最大值,32d時濃度為第2d濃度的3.4倍,為對照組的7.3倍.0.5mg/L組的肌肉組織中TBBPA含量隨暴露時間延長緩慢升高,高濃度組在第8d出現(xiàn)吸收高峰,后快速下降,在暴露終點又顯著回升,為對照組的4倍.低濃度組鰓中TBBPA隨時間變化幅度較小,第32d與對照組極為接近,高濃度組第 4d時出現(xiàn)吸收高峰,32d時為對照組的5.2倍.

結(jié)果顯示,各濃度組肝臟和腎臟 TBBPA含量都表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢,鰓和肌肉在0.5mg/L時TBBPA含量變化不大,高濃度時先升高后下降,肌肉在暴露后期又出現(xiàn)升高趨勢.

2.2 TBBPA在鯽魚不同組織器官的生物富集

根據(jù)時間(x)和TBBPA在鯽魚不同組織器官的濃度(y)擬合得到式(1),符合毒代動力學一級吸收模型,根據(jù)所得方程得到各個參數(shù)見表1,TBBPA暴露實驗中各器官組織富集系數(shù)(a)隨暴露時間的變化見圖2.

式中:y為TBBPA在鯽魚不同組織器官的濃度;x為暴露時間;擬合公式后得到參數(shù)a,b,x0,其中,a為各器官組織富集系數(shù);x0為相應變化時間.

結(jié)果顯示,各器官富集系數(shù)隨暴露時間的延長先升高再逐漸減小.在實驗濃度下肝臟富集系數(shù)相近,最大富集系數(shù)為 395,均落在 10～11d之間;0.5mg/LTBBPA組鯽魚腎臟的最大富集系數(shù)為 945,2.0mg/L組腎臟的富集系數(shù)遠小于0.5mg/L處理組,表明鯽魚腎臟功能可能受損不能執(zhí)行正常的排泄和解毒機能.2.0mg/L組鯽魚鰓的富集系數(shù)顯著高于 0.5mg/L組,最大富集系數(shù)為72,時間為10.26d,肌肉富集系數(shù)變化不大.

圖1 TBBPA在鯽魚不同器官的組織分布Fig.1 Tissue distribution of TBBPA in Carassius auratus

表1 鯽魚各器官的富集系數(shù)及參數(shù)Table 1 Bioaccumulation factor and the parameters in

2.3 TBBPA暴露對鯽魚器官組織的組織病理變化

對照組肝組織切片(圖3A)的肝細胞呈多角型,細胞核大而圓,核仁居中,胞質(zhì)染色深,細胞膜界限清晰.暴露后2d,肝細胞輕微腫脹,胞質(zhì)淡染,部分細胞空泡化,單位面積內(nèi)肝細胞數(shù)量減少.暴露后 4～8d,肝細胞腫脹嚴重,肝細胞索狀結(jié)構(gòu)破壞,肝細胞彌散.暴露后 16d,肝細胞索狀結(jié)構(gòu)消失,部分細胞的胞膜破裂、溶解,胞漿基質(zhì)變淡,胞核高度濃縮,有的甚至核仁都不可見,發(fā)現(xiàn)色素沉積物.暴露后32d(圖3B),肝細胞腫脹擴展到整個肝,細胞基質(zhì)大量丟失,胞核固縮(壞死),高濃度組中發(fā)現(xiàn)大量色素沉積物,經(jīng)普魯士藍染色證實為含鐵血黃素沉積物.實驗中暴露TBBPA后,鯽魚肝臟表現(xiàn)出時間-劑量依賴性的病理損傷,具體分析見表 2,說明肝臟可能是TBBPA作用的靶器官.

對照組腎組織切片(圖 3C)的正常腎小體為一圓囊結(jié)構(gòu),腎小球是一團毛細血管,腎小囊包在腎小球外面,兩層之間為腎小囊腔.暴露后 2～4d,腎小管中有彌散的色素沉積,部分腎小球毛細血管明顯萎縮,甚至壞死,并在腎小管上皮細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量色素沉積物.暴露后 8～16d,腎小球毛細血管明顯萎縮,腎小囊腔變寬,腎小球及其附近區(qū)域發(fā)現(xiàn)大片的色素沉積物,腎小管上皮細胞中色素沉積增多.暴露后32d(圖3D),腎小球囊內(nèi)大片的色素沉積,可能為壞死的腎小球毛細血管球殘骸,經(jīng)普魯士藍染色證明是含鐵血黃素.暴露TBBPA后腎臟的病變呈時間依賴性增長,具體分析見表3,主要表現(xiàn)為腎小球毛細血管萎縮、壞死,腎小囊腔變寬,腎小球及腎小管上皮細胞內(nèi)色素沉積增多,但兩劑量組之間差異不顯著.

圖2 長期暴露后TBBPA在鯽魚不同器官組織的生物富集系數(shù)(BCF)變化Fig.2 Bioconcentration factor (BCF) of TBBPA in different tissues of Carassius auratus after longterm exposure

對照組鰓絲切片(圖 3E)結(jié)構(gòu)完整清晰,鰓小片排列整齊有序.暴露后 2～4d,鰓切片中觀察到鰓小片上皮細胞輕度增生,部分還伴有鰓小片細胞的脫落,使鄰近鰓小片相互粘連.暴露后 8～6d,鰓小片上皮細胞增生加劇,部分鰓小片扭曲、細胞脫落.暴露后 32d(圖 3F),在兩劑量組均可觀察到鰓小片大量融合.

表2 鯽魚肝組織結(jié)構(gòu)隨暴露時間變化Table 2 Liver structure changes of Carassius auratus with time in chronic exposure test

表3 鯽魚腎組織結(jié)構(gòu)隨暴露時間變化Table 3 Kidney structure changes of Carassius auratus with time in chronic exposure test

圖3 鯽魚TBBPA暴露的器官組織病理觀察Fig.3 Observation of histopathology exposured TBBPA in Carassius auratus

對照組精巢切片(圖 3G)可見排列整齊完整的精小葉,精小葉腔內(nèi)充滿大量的精子細胞,核圓形,較致密,聚集在一起形成大的團塊.暴露后 2～4d,精小葉排列混亂,基膜局部溶解,間質(zhì)細胞增多.暴露后8～16d,精小葉基膜部分溶解,小葉間質(zhì)進一步擴大.暴露后 32d(圖 3H),精小葉基膜相互溶解,精子聚集在一起形成大的團塊,基膜外間質(zhì)細胞局部增多.

對照組和兩劑量組卵巢切片觀察(圖3I,J),卵母細胞呈圓形、橢圓形或多角形,細胞質(zhì)嗜堿性,核淺藍色,位于細胞中央.核仁沿核膜內(nèi)緣分布.經(jīng)對比發(fā)現(xiàn),對照組與處理組未見異常現(xiàn)象.

3 討論

肝臟是生物體最主要的物質(zhì)代謝場所和解毒器官,污染物易造成肝臟的脂肪化和細胞擴增等組織損傷[14],還可造成線粒體囊泡化和細胞核損傷等超微結(jié)構(gòu)的變化[15].組織學研究表明,TBBPA能引起孕期小鼠的肝臟損傷[16].本研究結(jié)果表明,TBBPA暴露對肝臟表現(xiàn)為時間-劑量依賴性關(guān)系,同時病理切片顯示,鯽魚肝細胞空泡變性,細胞核膜破裂、核仁溶解消失,部分肝細胞壞死,表明 TBBPA蓄積對肝臟具有較強毒害作用[17-19].陳瑪麗等[20]發(fā)現(xiàn) TBBPA 低劑量(0.025,0.25mg/L)暴露12周能夠引起紅鯽肝臟脂肪化、空泡化和線粒體囊泡化等現(xiàn)象,而高劑量暴露還導致肝臟細胞核損傷和細胞間隙增大等現(xiàn)象,造成紅鯽肝臟的損傷.這可能與污染物通過引起肝臟的物質(zhì)代謝紊亂[20],或者通過誘導活性氧的產(chǎn)生導致肝臟細胞代謝增強, 進而引起肝臟中物質(zhì)代謝紊亂[21-24]有關(guān).

腎臟是魚體最重要的毒物排泄器官,腎功能受損時,以腎臟作為主要去除途徑的毒物消除速度減慢,可產(chǎn)生蓄積和病變,排泄 TBBPA 機能受損,導致血液 TBBPA含量升高使血流不豐富的肌肉組織也出現(xiàn) TBBPA的積累現(xiàn)象.Schauer等[25]在研究小鼠一次口服300mg TBBPA/kg bw的代謝動力學時發(fā)現(xiàn),TBBPA在小鼠體內(nèi)的代謝半衰期為13h,由于TBBPA與谷胱甘肽等生物轉(zhuǎn)化酶或發(fā)生硫化反應使其生物利用性降低,TBBPA對機體的損害是通過與受體或酶的結(jié)合進行的.而 kang等[26]研究發(fā)現(xiàn)小鼠完全排泄TBBPA需要2d,TBBPA不會在體內(nèi)積累,對腎臟沒有損傷.本研究表明低濃度 TBBPA暴露鯽魚肝臟和腎臟可正常代謝,高濃度組則代謝受阻.這可能與 TBBPA隨血液進入腎臟后,自由基對細胞中的各種酶造成損傷,使魚類機體抗氧化系統(tǒng)損傷所致[27-28],產(chǎn)生蓄積和病變,排泄機能受損有關(guān).

本研究中鯽魚精巢的病理損傷嚴重,精小葉基膜破裂,這可能導致小葉內(nèi)部環(huán)境的紊亂,激素營養(yǎng)物質(zhì)的平衡受到破壞,不利于精子的成熟和發(fā)育,這一結(jié)論與陳瑪麗[29]的研究結(jié)果一致,而本研究同時發(fā)現(xiàn),在相同 TBBPA濃度暴露下鯽魚卵巢組織未發(fā)現(xiàn)病理損傷,表明 TBBPA暴露下鯽魚精巢比卵巢更易受到毒害威脅.在對鯽魚鰓切片的的觀察表明,鰓小片上皮細胞大面積增生、融合會嚴重影響鰓的正常氣體交換,這必然影響鰓的呼吸、分泌和排泄功能,這些與在試驗過程中觀察到的實驗組的魚經(jīng)常將嘴露出水面或鰓蓋煽動速度加快的缺氧現(xiàn)象相吻合.

4 結(jié)論

4.1 組織分布動力學的研究表明,肝臟和腎臟是 TBBPA含量最高的部位,具有較強生物富集能力. 在暴露10～11d時,肝臟和腎臟富集能力最強,最大富集系數(shù)分別達到395和945.鰓和肌肉的富集能力較低.

4.2 不同濃度 TBBPA暴露后,鯽魚肝臟、腎臟和鰓均表現(xiàn)出時間-劑量依賴性的病理損傷,低濃度肝組織切片未見明顯病變; 腎臟有彌散性沉積;鰓小片上皮細胞輕度增生,部分伴有鰓小片細胞的脫落,后期有融合現(xiàn)象.高濃度肝細胞腫脹嚴重,肝細胞索狀結(jié)構(gòu)破壞,肝細胞彌散,細胞基質(zhì)大量丟失,胞核固縮;腎小球毛細血管明顯萎縮,甚至壞死;鰓小片上皮細胞的大面積增生,致使數(shù)條鰓小片融合在一起.

4.3 在相同暴露濃度下,雄魚的性腺損傷程度高于雌魚.精巢在2.0mg/L TBBPA暴露下病理損傷嚴重,卵巢未發(fā)現(xiàn)明顯病變.

[1]Hale R C, Alaee M, Manchester-neesving J B, et al.Polybrominated diphenyl ether flame retardants in the North American environment [J]. Environ. Int., 2003,29:771-779.

[2]Watanabe I, Kashimoto T, Tatsukawa R, et al. Identification of the flame retardant tetrabromobisphenol A in the river sediment and mussel collected in Osaka. Bull. Environ [J]. Contam. Toxicol.,1983,31:48-52.

[3]De Wit C A. An overview of brominated flame retardants in theenvironment [J]. Chemosphere, 2002,46:583-624.

[4]Cariou R, Antignac J P, Zalko D, et al. Exposure assessment of French women and their newborns to tetrabromobisphenol-A:occurrence measurements in maternal adipose tissue, serum,breast milk and cord serum [J]. Chemosphere, 2008,73:1036-1041.

[5]Geens T, Roosens L, Neels H, et al. Assessment of human exposure to bisphenol-A, triclosan and tetrabromobisphenol-A through indoor dust intake in Belgium [J]. Chemosphere,2009,76:755-760.

[6]Labadie P, Tlili K, Alliot F, et al. Development of analytical procedures for trace-level determination of polybrominated diphenyl ethers and tetrabromobisphenol A in river water and sediment [J]. Anal. Bioanal. Chem., 2010,396:865-875.

[7]張普青,李玉文,李敬瑤,等.巢湖沉積物及水體中四溴雙酚 A濃度分布及時空分布特征 [J]. 內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟, 2011,5(31):51-55.

[8]肖 瀟,陳德翼,梅 俊,等.貴嶼某電子垃圾拆解點附近大氣顆粒物中氯代/溴代二英、四溴雙酚A污染水平研究 [J]. 環(huán)境科學學報, 2012,32(5):1142-1148.

[9]楊蘇文,王圣瑞,閆振廣,等.四溴雙酚A在5種巢湖魚類體內(nèi)的組織分布與生物濃縮因子研究 [J]. 環(huán)境科學, 2012,33(6):1852-1857.

[10]Yang S W, Yan Z G, Xu F F, et al. Developme nt of freshwater aquatic life criteria for Tetrabromobisphenol A in China [J].Environmental Pollution, 2012,169:59-63.

[11]Li H, Jiang H, Gao X, et al. Acute toxicity of the pesticide methomyl on the topmouth gudgeon (Pseudorasbora parva):Mortality and effects on four biomarkers [J]. Fish Physiol.Biochem., 2008,34:209-216.

[12]孫翰昌,丁詩華,陳大慶,等. Cu2+對中華倒刺鲃抗氧化功能的毒理效應 [J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2006,25(1):69-72.

[13]GB 21808-2008 生態(tài)毒理試驗方法 [S]. 北京:中國標準出版社, 2010.

[14]Nero V, Farwell A,Lister A, et al. Gill and liverhistopathologicalchanges in yellowperch (Perca flavescens)and goldfish (Carassius auratus) exposed to oil sands processaffected water [J]. Ecotoxicol. Environ. Saf., 2006,63(3):365-377.

[15]Hugla J L, Thome J P. Effects of polychlorinated biphenyls on liver ultrastructure, hepatic monooxygenases, and reproductive success in the barbel [J]. Ecotoxicol. Environ Saf,. 1999,42(3):265-273.

[16]Tada Y, Fujitan I T, Ogat A A, et al. Flame retardant tetrabromobisphenol A induced hepatic changes in ICR male mice[J]. Environ. Toxicol. Pharmacol., 2007,23(2):174-178.

[17]Weater P W, Canton J H. Histopathological study ofPoeciliareticulata( guppy) after long-term exposure to bis( tri-n-butyltin)oxide (TBTO ) and di-n-butyltindichloride(DBTC) [J]. Aquatic toxicology, 1987,10:143-165.

[18]Weater P W, Canton J H, Van Iersel A A J, et al. The toxicity of bis( tri-n-butyltin) oxide( TBTO) and di-n-butyltindichloride( DBTC) in the small fish speciesOryzias latipes( medaka) andPoecilia reticulata guppy[J]. Aquatic Toxicology, 1990,16:53-72.

[19]王錫珍,陸宏達.關(guān)于阿維菌素對異育銀鯽的急性毒性和組織病理研究 [J]. 大連水產(chǎn)學院學報, 2010,25(1):66-70.

[20]陳瑪麗,瞿臻琰,劉青坡,等.四溴雙酚 A和五溴酚對紅鯽肝臟組織和超微結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 安全與環(huán)境學報, 2008,8(4):8-11.

[21]Ronisz D, Farmen F E, Karlsso H N, et al. Effects of the brominated flame retardants hexabromocyclododecane (HBCDD),and tetrabromobisphenol A (TBBPA), on hepatic enzymes and other biomarkers in juvenile rainbow trout and feral eelpout [J].Toxicology, 2004,69:229-245.

[22]Shi H, Wang X, Karlsso H N, et al. Electron paramagnetic resonance evidence of hydroxyl radical generation and oxidative damage induced by tetrabromobisphenol A in carassius auratus [J].Aquatic toxicology, 2005,74(4):365-371.

[23]瞿璟琰,姚晨嵐,施華宏,等.四溴雙酚A和五氯酚對紅鯽甲狀腺組織結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 環(huán)境化學, 2007,26(3):29-32.

[24]瞿璟琰,施華宏,劉青坡,等.四溴雙酚-A和五溴酚對紅鯽甲狀腺激素和脫碘酶的影響 [J]. 環(huán)境科學學報, 2008,28(8):1625-1630.

[25]Schauer U M D, V?lkeland W, Dekant W. Toxicokinetics of tetrabromobisphenol A in humans and rats after oral administration [J]. Toxicol. Sci., 2006,91(1):49-58.

[26]Kang M J, Kim J H, Shin S, et al. Nephrotoxic potential and toxicokinetics of tetrabromobisphenol a in rat for risk assessment[J]. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A:Current Issues, 2009,72:1439-1445.

[27]張紅梅,姜會民.分子氨對黃河鯉魚血清抗氧化反應的影響 [J].西南大學學報, 2011,33(8):88-93.

[28]姜會民.氨氮脅迫對黃河鯉幼魚肝胰臟、腎臟抗氧化性的影響[J]. 山東大學學報(理學版), 2012,47(1):17-22.

[29]陳瑪麗.四溴雙酚-A對魚類的毒性效應 [D]. 上海:華東師范大學, 2008.