生產用菌種篩選過程中西林控制的研究

(廣東溢多利生物科技股份有限公司科研中心, 廣東 珠海 519060)

谷氨酸發酵生產的水平首先取決于生產用菌種的性能。菌種在使用和保藏過程中會出現衰退現象，要穩定并提高發酵水平，必須定期對菌種進行分純篩選，淘汰衰退的菌株，篩選出高產穩定的優良菌株供生產上使用。我廠是以甘蔗糖蜜為原料，采用在發酵對數生長期添加青霉素，然后再添加表面活性劑的發酵工藝。為了更好的服務于生產，根據實際操作情況，使得菌種篩選也盡量與生產發酵工藝相統一。

1 實驗目的

1.1 根據生產用菌種的性能，摸索出一套合適的菌種篩選方法。

1.2 確定搖瓶篩選生產用菌種過程中西林的最佳控制時間和濃度。

2 實驗原理

在發酵對數生長期早期添加青霉素能抑制菌體細胞壁的合成，形成不完全的細胞壁，進而導致形成不完全的細胞膜，除去阻礙谷氨酸向外滲透的障礙物，使得谷氨酸得以大量地積累。

作用機制：添加青霉素是抑制谷氨酸生產菌細胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽轉肽酶影響細胞壁肽聚糖的生物合成。因為青霉素的結構和革蘭氏陽性的谷氨酸菌所特有的糖肽的D-Ala-D-Ala 末端結構類似，因而它取代合成糖肽的底物而和酶的活性中心結合，使五肽末端的丙氨酸不能被轉肽酶移去，甘氨酸橋-頭無法與它前面一個丙氨酸相接，因此交聯不能形成，網狀結構連接不起來，糖肽合成就不能完成，于是菌體內尿二磷和N-乙酰胞壁酸大量堆積，青霉素與轉肽酶相結合，形成了青霉素的酶。結果形成不完全的細胞壁，導致形成不完全的細胞的滲透壓差，進而導致細胞膜的物理損傷，形成不完全的細胞膜，失去滲透障礙物，增大了谷氨酸向胞外分泌的滲透能力。

3 實驗器材

3.1 實驗儀器

722可見光電子分光光度計、雷磁酸度計、離心機、SBA-40C生物傳感分析儀旋轉式搖床、超凈工作臺等。

3.2 實驗材料

種子培養基：糖份6%、KH2PO40.2%、尿素1.4%。

發酵培養基：糖份 15%、H3PO40.1%、消泡油適量。

40%尿素溶液、42%流加糖、1/萬青霉素鉀溶液。

4 實驗方法

4.1 種子培養

在超凈工作臺上無菌操作，從谷氨酸菌斜面挑取適量菌種接入裝有250ml種子培養基的2L 搖瓶中，雙層紗布封口。置于旋轉式搖床上（850r/min），32℃振蕩培養12小時后進行OD 、PH、CV值測定。

4.2 發酵培養

?

取上述種液3ml 接入裝有20ml 發酵培養基的250ml搖瓶中，加入40%尿素溶液0.6ml，雙層紗布封口，置于旋轉式搖床上（850r/min），32℃振蕩培養至指定時期加入1/萬濃度青霉素鉀溶液。加完青霉素鉀溶液后，改雙層紗布為單層封口，調搖床轉速為1000 r/min 振蕩培養。發酵過程中根據需要流加適量尿素和流加糖。發酵32小時后，對發酵液進行OD 、PH、GA值測定。

4.3 分析方法

OD值測定：吸取樣品液，用蒸餾水稀釋50 倍，以蒸餾水作為空白對照，采用722可見光電子分光光度計于1cm 光程在波長696 nm 處測定。

CV值測定：吸取樣品液10 ml，采用離心機以3500 r/min 的速度離心10分鐘。

PH值測定：采用雷磁酸度計直接測定。

GA值測定：吸取樣品液，用蒸餾水稀釋100倍，采用SBA-40C 生物傳感分析儀測定。

5 結果與分析

本實驗中設計青霉素加入的指定時期分為6種不同的OD值階段，加入青霉素的濃度分為4種濃度。共做3批搖瓶發酵試驗，同一時期同一濃度每批3 瓶。表一為不同時期不同濃度青霉素添加的搖瓶發酵實驗GA分析結果。從表一中可以看出，在OD值為0.38-0.42這個階段加入1/萬青霉素溶液0.7 ml的效果最好。

總之，在生長的某階段添加青霉素是影響產量的關鍵因素，加的太早會抑制菌體生長，不能獲得足夠的菌體量；加的太遲菌體已經充分增殖，形成完整的細胞壁，青霉素不起作用。因此必須在增殖過程的適當時期添加，并且必須在添加后再進行一定的增殖。新增殖的細胞沒有充足的細胞壁合成，菌體形態急劇變化，多呈現伸長、膨潤的菌型，完成谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞的轉變。

[1]肖冬光.微生物工程原理.北京：中國輕工業出版社，2004.

[2]于信令.味精工業手冊.北京：中國輕工業出版社，2009.