在線固相萃取——高效液相色譜法檢測人血清中氯氮平濃度

張文英，郭莉萍，沈廣虎

(1 天津市安定醫院，天津 300222;2 戴安中國有限公司)

目前在國內，氯氮平已廣泛應用于非典型抗精神病的治療，其鎮靜作用強，具有強大的抗精神病效應，對精神病陽性和陰性癥狀均有良好的療效，且較少引起錐體外系反應［1］。所以對患者服用氯氮平后體內的血藥濃度的監測并建立有效快速的血清氯氮平的檢測方法具有現實意義。目前檢測血清中氯氮平的常規方法是先將血清進行離線預處理，再進行色譜檢測分析，血清的前處理方法非常繁瑣，且屬于有毒作業，同時離線前處理增加了人為干擾因素，影響結果的準確性。為此我們建立一種在線固相萃取(SPE)前處理方法檢測血清中的氯氮平，探討其準確性和合理性。

1 材料與方法

1.1 材料 Dionex Ultimate 3000系列(Thermo Fisher);脫氣機:SRD-3600(PN:5035.9230);泵:DPG-3600SD(PN:5040.0061);自動進樣器:WPS-3000SL(PN:5822.0020);柱溫箱:TCC-3200(PN:5722.0035);檢 測 器:DAD-3600(RS)(PN:5082.0020);色譜軟件:Chromeleon Chromatography Data System。氯氮平對照品(湖南洞庭制藥提供，批號20081101 純度 99.9%)，色譜純甲醇(Sigma，批號 MKBH8418V)，色 譜 純 乙 腈 (Sigma，批 號WXBB0245V)，醋酸銨(分析純天津贏達試劑，批號2012914)，超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 分析柱:Acclaim 120 C18，4.6*250 mm，5 μm(PN:059149:SN:004806);SPE 柱:Capcell MF Ph-1，4.0 ×10(資生堂，12416 guard cartridge);流動相:H2O(100 mM NH4Ac)、乙腈;柱溫:30℃;進樣量:100 μL;流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm。

1.2.2 梯度條件 見表1。

1.2.3 氯氮平儲備液及工作液的配制 精確稱取50 mg氯氮平對照品溶于50 mL甲醇中制成1 mg/mL的儲備液，用甲醇將儲備液分別稀釋成濃度為1～80 μg/mL的工作液。

1.3.4 樣本預處理 將標準血清或患者血清10000 r/min離心10 min，取上清直接上機進樣。

表1 SPE柱及分析柱梯度條件

2 結果

2.1 專屬性實驗 在本實驗條件下，不同濃度血清氯氮平對照品的色譜圖見圖1。由圖1可知，標準品氯氮平的色譜峰能完全分離，沒有明顯的內生雜質峰干擾，可見本方法具有較高的專屬性;氯氮平的保留時間為10.783 min。

2.2 標準曲線的制備 將不同濃度的工作液分別加入空白血清中制成濃度為 20、50、100、200、400、800、1600 ng/mL的標準血清樣本，作為外標液。將外標液10000 r/min離心10 min取上清上機進行檢測，以濃度為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y繪制標準曲線，Y=0.0042X，r=0.9997，n=7。最低檢出限1.5 ng/mL(S/N=3)。見圖 2。

圖1 不同濃度氯氮平標準血清色譜圖

圖2 不同濃度的標準血清制成的標準曲線

2.3 精密度實驗 取氯氮平低、中、高濃度(50、200、800 ng/mL)含藥血清樣本，重復檢測5次為1批次，再重復測定4批次，色譜分析所得結果經統計學分析計算其批內和批間的精密度見表2。

2.4 回收率 取氯氮平低、中、高濃度(50、200、800 ng/mL)含藥血清樣本，1 d內重復檢測5次，色譜分析所得結果經統計學分析，得到回收率和回收RSD見表3。

表2 在線前處理法測定氯氮平批內批間精密度(n=5)

表3 在線前處理法測定氯氮平的方法回收率(%)

3 討論

目前氯氮平作為精神科的常用藥物已廣泛應用于臨床。臨床上對氯氮平的檢測均采用254 nm紫外吸收波長［2］，故本試驗亦采用254 nm波長檢測。傳統血清藥物濃度測定方法均需對待測樣本進行離線預處理。傳統預處理方法主要包括去蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。有研究顯示，相比前兩種預處理方法，固相萃取法操作更簡單、用時少，通過比較同一血漿提取后的含量測定色譜圖［3］，可見經固相萃取的樣本雜質明顯減少，因此可減輕對色譜柱的影響，延長其使用壽命［4，5］。但離線預處理過程中會造成提取率不穩定，而且操作繁瑣，增加了人為干擾因素，且有機溶劑對工作人員造成傷害。

本研究采用在線SPE樣本預處理，該方法自動化程度高，且避免了人為干擾因素，批內批間RSD均＜2%。在許多文獻［2］中顯示，采用離線預處理方法檢測氯氮平其批內批間RSD為5%～7%，甚至接近10%，在線前處理分析所得結果經統計學處理，其精密度及回收率均符合生物樣品分析要求，且其精密度有很大提高［5］。總之，該方法操作簡便、快速、精確，可大批量檢測臨床樣本，滿足臨床藥物濃度監測需要。

［1］陳新謙.新編藥物學［M］.16版.北京:人民衛生出版社，2007:272.

［2］劉偉忠，陳清霞，黃偉僑，等.高效液相色譜法同時測定人血漿中氯氮平與氟西汀的濃度［J］.廣東藥學院學報，2011，27(3):243-246.

［3］梅艷，宋新文，汪洋.固相萃取高效液相色譜法測定氯氮平血藥濃度［J］.中國臨床藥理學雜志，2012，28(6):456-457.

［4］李冬梅，丁學開，梁民琦，等.固相萃取用于血漿中抗癲癇藥物的提取［J］.中國現代應用藥學，1999，6(16):132-134.

［5］魚愛和，劉平，范武峰，等.測定氯氮平血藥濃度臨床意義的探討［J］.中國臨床藥理學雜志，1994，10(1):27-31.