Taq DNA聚合酶的制備和純化

詹慶才，詹祎捷，劉之熙，朱克永

（1.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125；2.北京聯合大學應用文理學院，北京 100083）

PCR技術被廣泛應用于分子生物學、食品科學、醫學等相關研究領域。作為PCR技術的主要試劑的Taq DNA聚合酶用量日益增多。而目前大多數實驗室主要依賴公司商品化的Taq DNA聚合酶。為了降低研究和開發成本，一些實驗室利用不同的分離純化方法生產Taq DNA聚合酶[1-4]。湖南省水稻研究所生物技術室利用含Taq DNA聚合酶基因的p Taq表達質粒轉化大腸桿菌E.coli菌株，誘導表達耐熱Taq DNA聚合酶，然后提取純Taq DNA聚合酶，并用考馬斯亮藍法和PCR分析其純度、濃度和活性。該技術旨在制備Taq DNA聚合酶，降低分子生物學實驗成本。

1 材料與方法

1.1 材 料

含Taq酶基因的載體p Taq由中國科學院遺傳與發育研究所提供，氨芐青霉素（Amp）、溶菌酶、苯甲基磺酰氟（PMSF）、異丙基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker等生物化學試劑購自鼎國生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外源基因在大腸桿菌中的表達 取出菌種，將少許的冰凍菌種培養物在LB平板（含Amp100 mg/mL）上劃線，37℃培養 16～20 h。挑取單菌落接種到6 mL含100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜；用1.25 mL過夜培養的菌種接種到250 mL的LB液體搖瓶中（Amp終濃度為100 mg/mL），37℃培養4.5 h；在總量1 000 mL的培養液中加入120 mg的IPTG誘導（終濃度為0.5 mmol/L）。培養液在37℃，繼續培養16～20 h。

1.2.2 重組Taq DNA聚合酶的提取 3 000 g離心20 min收集菌體，每1 000 mL菌液離心后加入60 mL（30 mL×2）溶液 A（50 mmol/L Tris-HCl pH值 8.0；50 mmol/L Dextrose （glucose）；1 mmol/L EDTA）中重懸；將收集菌體洗，7 000 g離心10 min重新收集菌體。菌體再懸在40 mL（20 mL×2）溶液A中，混勻。加入終濃度為4 mg/mL的lysozyme（Sigma），室溫（25℃）放置 15 min。加入 40 mL的溶液B（10 mmol/L Tris-HCl pH值 8.0；50 mmol/L KCl；1 mmol/L EDTA （pH 值 8.0）；1 mmol/L PMSF；0.5%Tween 20；0.5%NP-40），75℃水浴保溫1 h，期間要晃動幾次。4℃，10 000 g離心20 min重新收集上清液。……