亞臨界水萃取陳皮中橙皮苷的工藝研究

齊 兵，何志勇，秦 肪，張連富，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

陳皮（Pericarpium Citri Reticulate）為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，是我國傳統中草藥之一[1]。橙皮苷（Hesperidin）為陳皮的有效活性成分，其純品為白色針狀晶體，分子式C28H34O15，相對分子量610[2]。研究表明，橙皮苷具有抗氧化[3]，抑菌消炎、抗病毒、抗癌[4-7]，預防心血管病癥，維持血管正常滲透壓、降低血管脆性、降血脂和防治動脈粥樣硬化等生理功能，具有很高的藥用價值[8-9]。目前，橙皮苷的提取方法主要是溶劑浸提和堿提酸沉，這些方法普遍存在得率低、耗時長以及提取物中易殘留溶劑等問題。亞臨界水又稱高壓熱水、超加熱水或熱液態水，是指在一定的壓力下，將水加熱到100℃以上臨界溫度374℃以下的高溫，水仍然保持在液體狀態[10]。亞臨界水萃取技術是近十幾年來發展起來的一種新型綠色提取技術，采用價廉、無毒、無污染的水作為萃取劑，通過調節溫度、壓力使水的極性在較大范圍內變化，可以選擇性地提取不同極性的化合物，具有萃取效率高、時間短、環境友好等優點。本文研究了亞臨界水萃取陳皮中橙皮苷的工藝條件，并與傳統的乙醇熱回流提取方法進行對比，為橙皮苷的短時高效，環境友好的工業化生產提供了理論依據，對于提高陳皮資源的綜合利用率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陳皮條（3cm×0.5cm）購自毫州市永剛飲片廠有限公司；橙皮苷標準品 購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110721-201014；乙醇、冰醋酸 分析純；甲醇 色譜純。

亞臨界萃取設備（HL-SF-2L/20MPa/400℃-H2O）杭州華黎泵業；高效液相色譜儀（P3000A高壓輸液泵、UV3000型紫外檢測器 北京創新通恒科技有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，R-205型旋轉蒸發儀 上海申順生物科技有限公司；ZK-072型真空干燥箱 上海市實驗儀器廠；冰箱 無錫小天鵝股份有限公司；KJ-300超聲波發生器 無錫市科潔超聲電子設備有限公司；SHB-111A型循環水式多用處真空泵 上海豫康科教儀器設備有限公司；AB104-N型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜檢測條件 Daiso-C18反相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相[11]：甲醇∶6%醋酸=38∶62；pH=2.91；檢測波長284nm；流速1.0mL/min；柱溫25℃；進樣量20μL。

1.2.2 橙皮苷標準曲線的繪制 精確稱取橙皮苷標準品10.3mg，用甲醇超聲溶解，定容至50mL容量瓶中，制得濃度為0.206mg/mL的橙皮苷標準品儲備液。精確吸取橙皮苷儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL用50%甲醇溶液定容至10mL容量瓶中。分別吸取上述溶液20μL進樣，測定峰面積值，以峰面積值Y為縱坐標，橙皮苷濃度X為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 陳皮原料的篩選及處理 由于粉末易造成設備堵塞，因此本實驗采用條狀陳皮作為萃取原料。挑選出尺寸為（3～4）cm×（0.5～1）cm的陳皮條，于50℃的烘箱中干燥至恒重，然后放置于干燥器中保存備用。

1.2.4 橙皮苷提取得率 計算公式如下：

橙皮苷提取得率（%）=（提取得到橙皮苷質量/陳皮條質量）×100

1.2.5 亞臨界水萃取實驗 準確稱取陳皮條原料50.0g放置于萃取釜中，密封好頂蓋，設定蒸餾水流速為4L/h，開啟壓力泵后輸入蒸餾水，直至充滿整個萃取裝置。在輸水的過程中可設置預熱釜溫度到80℃。等到接收處有蒸餾水流出時，按照實驗設計，分別設置預熱釜溫度、萃取釜上體及下體溫度、蒸餾水流速以及萃取壓力，當萃取釜內條件達到預設值后，開始計時提取，提取液經過急冷器與冷卻釜降溫后流出，用收集容器接收提取液。亞臨界水萃取裝置的結構示意圖如圖1所示。

圖1 2L亞臨界水萃取裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of 2L subcritical water extraction apparatus

將收集到的提取液在60℃下真空旋轉蒸發至原體積的1/10，將濃縮液放置于4℃冰箱冷卻過夜至沉淀完全，減壓過濾，收集沉淀，65℃下真空干燥至恒重。采用HPLC法檢測粉末中橙皮苷的含量，并按照1.2.4的方法計算橙皮苷的提取得率。以橙皮苷的提取得率為指標，分別考察萃取溫度、壓力、蒸餾水流速及萃取時間對亞臨界水萃取效果的影響。

1.2.6 乙醇熱回流提取實驗 應用前期研究得到的最佳工藝條件[12]：乙醇濃度75%、溫度85℃、料液比1∶35（g∶mL）、提取時間150min，進行乙醇熱回流提取，并與亞臨界水萃取的效果進行對比。

2 結果與討論

2.1 萃取溫度對橙皮苷提取得率的影響

在萃取壓力為6MPa，蒸餾水流速40mL/min，提取時間120min的條件下，分別設定萃取溫度為100、120、140、160、180℃，考察溫度對橙皮苷提取得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 溫度對橙皮苷提取得率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of hesperidin

從圖2中可以看出，溫度低于140℃時，隨著溫度的升高橙皮苷的提取得率增加，這是由于升高溫度，水的極性、表面張力和粘度都急劇下降[13]，其性質更加接近于有機溶劑，使室溫下難溶于水的橙皮苷溶解度增加。但是當溫度超過140℃后，繼續提高溫度橙皮苷的提取得率反而下降，一方面是由于溫度升高后陳皮中的纖維素、半纖維素、果膠[14]等物質在亞臨界水中的溶解也會增加，阻礙了橙皮苷的溶解；另一方面受到橙皮苷熱穩定性的限制，溫度過高還會造成橙皮苷的分解。因此，選擇亞臨界水萃取橙皮苷的最佳溫度為140℃。

2.2 萃取壓力對橙皮苷提取得率的影響

在萃取溫度140℃，蒸餾水流速40mL/min，提取時間120min的條件下，分別調節萃取壓力為6、9、12、15MPa，考察萃取壓力對橙皮苷提取得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 壓力對橙皮苷提取得率的影響Fig.3 Effect of pressure on extraction rate of hesperidin

從圖3中可以看出，在保持溫度與蒸餾水流速不變的情況下，壓力增加對于橙皮苷的萃取得率影響不大。這是主要是由于壓力的變化對于水的介電常數和溶解能力影響比較小，有文獻報道稱[15]亞臨界水萃取的壓力從0.1MPa增加到10MPa時，水的介電常數僅僅增加了0.37，所以亞臨界水萃取壓力的選取只需要能夠使水維持在液體狀態即可。6MPa足夠維持水在100～200℃處于液體狀態，因此選擇亞臨界水萃取橙皮苷的最適壓力為6MPa。

2.3 蒸餾水流速與萃取時間對橙皮苷提取得率的影響

設置萃取溫度為140℃，壓力為6MPa，分別在蒸餾水流速為20、40、60mL/min的條件下提取，從0min開始每隔20min收集并檢測提取得到橙皮苷的含量?？疾煺麴s水流速與提取時間對橙皮苷得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 流速與萃取時間對橙皮苷提取得率的影響Fig.4 Effect of flow rate and time on the extraction rate of hesperidin

從圖4中可以看出，在相同的提取時間內，流速增大，橙皮苷的提取得率也相對提高。蒸餾水流速為40mL/min與60mL/min時的提取得率明顯高于20mL/min。這是由于水在流動的狀態下，一方面可以與固體物料之間發生攪動、碰撞、摩擦等作用；另一方面，能夠在固液相主體之間快速形成新的濃度梯度，因而增加流速能夠加速橙皮苷向水溶劑中的擴散運動。但當蒸餾水的流速由40mL/min增加到60mL/min時，橙皮苷的最大提取得率差別不大。但蒸餾水流速的增加會導致最終提取液體積的增加，給后續的提取液濃縮處理所工作造成困難。同時，提高流速也會增加壓力泵的負擔。綜合考慮以上因素，選擇40mL/min為最佳流速。

從圖4中還可以看出，在蒸餾水流速為40mL/min的條件下，當提取時間達到100min時，橙皮苷的提取得率基本不再增加，因此，提取時間選擇為100min。此時蒸餾水總流量為4000mL，其料液比為1∶80（g∶mL）（陳皮質量/蒸餾水體積）。

2.4 亞臨界水萃取驗證實驗

準確稱取50.0g陳皮條裝入萃取釜，在溫度為140℃，壓力6MPa，蒸餾水流速為40mL/min的條件下，提取100min，重復三次，進行驗證性實驗，結果見表1。

實驗結果表明，優選得到的亞臨界水萃取條件重復性好，穩定可行，因此最佳工藝條件有效可行。

表1 亞臨界水萃取驗證實驗Table 1 Verificafion test of subcritical water extraction

2.5 兩種提取方法的對比結果

表2為乙醇熱回流與優化得到的亞臨界水萃取橙皮苷的最佳提取工藝的提取條件與提取得率的對比結果。

表2 兩種提取方法對比結果Table 2 Contrast results of the two methods

從對比結果可以看出，亞臨界水萃取法相對于傳統的乙醇熱回流法提取得率高，萃取時間短，并且無需消耗有機溶劑，綠色環保，具備明顯的競爭優勢。

3 結論

研究得到亞臨界水萃取陳皮中橙皮苷的最佳提取條件為：萃取溫度140℃，壓力6MPa，流速40mL/min，提取時間100min，橙皮苷的提取得率為3.53%±0.05%。亞臨界水萃取法采用廉價、環保的水作為萃取溶劑，與傳統的乙醇熱回流提取法相比，具有提取時間短、得率高、無溶劑殘留等優勢。本研究將亞臨界水萃取技術應用于陳皮中橙皮苷的提取，是一種新探索，為亞臨界水萃取技術在植物提取領域的研究提供理論基礎，對于實現天然產物的綠色、高效工業化生產具有重要意義。

[1]梁支柱，唐衛東.對陳皮不同炮制品中黃酮類成分變化的研究[J].亞太傳統醫藥，2010，5（6）：34-35.

[2]Garg A，Gatg S，Zaneveld L J D，et al.Chemistry and pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin[J].Phytotherapy Research，2001，15（8）：655-669.

[3]Balakrishnan A，Menon V P.Antioxidant properties of hesperidin in nicotine-induced lung toxicity[J].Fundamental&Clinical Pharmacology，2007，21（5）：535-546.

[4]Mu ZY，Takana T，Yoshinobu H，et al.Chemopreventive effects of diosmin and hespefidin on N-butyl-N-（4-hydroxybutyl）nitrosamine-induced urinary-bladder carcinogenesis in male ICR mice[J].International Journal of Cancer，1997，73（5）：719-724.

[5]Park H J，Kim M J，Ha E，et al.Apoptotic effect of hesperidin through caspase3 activation in human colon cancer cells，SNUC4[J].Phytomedicine，2008，15（1）：147-151.

[6]Teresita G，Alejandra E R，Americo O J，et al.Antiinflammatory properties of plant flavonoids effects of rutin，quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat[J].Farmaco，2001，56（9）：683-687.

[7]Kim D H，Song M J，Bae E A，et al.Inhibitory effects of herbalmedicineson rotavirusinfectivity[J].Biologicaland Pharmaceutical，2000，23：356-360.

[8]Yamamoto M，Suzuki A，Hase T.Short-term effects of glucosyl hesperidin and hesperetin on blood pressure and vascular endothelial function in spontaneously hypertensive rats[J].Journal of nutritional science and Vitaminology，2008，54（1）：95-98.

[9]Ohtsuki K，Abe A，Mitsuzumi H，et al.Glucosyl hesperidin improves serum cholesterol composition and inhibits hypertrophy in vasculature[J].Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2003，49（6）：447-450.

[10]何健，夏凡.亞臨界水萃取技術在食品工業中的應用[J].江西食品工業，2010（1）：45-47.

[11]袁金斌，周志炎.HPLC測定陳皮提取物及制劑中橙皮苷的含量[J].中成藥，2006，28（3）：455-456.

[12]齊兵，何志勇，秦肪，等.陳皮中橙皮苷的提取與純化工藝研究[J].食品工業科技，2012，33（24）：343-346.

[13]Shalmashi A，Abedi M，Golmohammad F，et al.Isolation of caffeine from tea waste using subcritical water extraction[J].Journal of Food Process Engineering，2010，33（4）：701-711.

[14]Masahiro Tanaka，Arata Takamizu，Munehiro Hoshino，et al.Extraction of dietary fiber from Citrus junos peel with subcritical water[J].Food and Bioproducts Processing，2012，90（2）：180-186.

[15]吳仁銘.亞臨界水萃取在分析化學中的應用[J].化學進展，2002，14（1）：32-36.