益生乳桿菌質粒抗生素抗性基因與其耐藥性的相關性探討

韓俊華，李珊珊，裴家偉，陳大歡，張柏林

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083；3.河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

益生菌廣泛應用于保健食品、藥品、乳制品、飼料等各個行業，與人們的日常生活關系越來越密切。FAO/WHO在《用于食品的益生菌安全性評價指導原則》中指出，未經評估的益生菌可能會存在一些潛在的安全性問題，其中，長期使用的益生菌所攜帶耐藥基因的轉移是人們所擔憂的[1]。目前，抗生素濫用已成為一個嚴重的社會問題，由此引發的細菌耐藥性問題也日趨嚴峻。盡管傳統的益生菌菌種已有很長的安全使用歷史，如德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgricus），然而伴隨著新菌種的不斷開發和進入市場，其潛在的安全性問題也逐漸引起人們的重視。近十年來，有關乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的耐藥性方面已經開展了一定的研究工作。研究發現，大部分乳酸菌對抗革蘭陰性菌的抗菌藥具有耐藥性，例如鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素，其中部分乳桿菌對萬古霉素、卡那霉素、多黏菌素B等表現出抗藥性[2-4]。D’aimmo等報道了雙歧桿菌、乳桿菌、片球菌等對卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及與抗性有關的基因，如長雙歧（Bifidobacterium longum）抗四環素的基因tet（W），干酪乳桿菌（L.casei）抗四環素和紅霉素的質粒基因tet（M）和erm（B）等[5]。Toomey等和ANA等則進一步報道了抗四環素基因tet（M）在菌株間的轉移現象[6-8]。顯然，這種抗藥基因在菌種間的轉移會對人類的健康產生影響。食品是益生菌的主要載體，益生菌的安全性勢必影響到其食品的安全，因此其耐藥性以及抗生素抗性是否可轉移就會引起人們的重視。本研究對前期篩選到的幾株能夠耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶的乳桿菌的耐藥性進行了研究，通過質粒消除探討了耐藥性與質粒的相關性，對進一步確定耐藥性的轉移提供了理論基礎，旨在為潛在益生乳桿菌的安全性評價及其評價方法的建立提供理論和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5株耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶且含有質粒的乳桿菌 其菌種編號、名稱及來源見表1，該菌種均由中國工業微生物菌種保藏中心（CICC）收藏；抗生素敏感性實驗的質控菌株 采用CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute，臨床實驗室標準化研究所，簡稱CLSI，以前稱NCCLS）推薦的大腸桿菌ATCC25922，購自中國科學院微生物研究所；乳桿菌采用MRS培養基，37℃培養；大腸桿菌ATCC25922采用LB培養基，30℃培養；氨芐西林10μg/片、桿菌肽0.04U/片、青霉素G 10U/片、多粘菌素B 300μg/片、利福平5μg/片、頭孢噻吩30μg/片、鏈霉素10μg/片、卡那霉素30μg/片、四環素30μg/片、氯霉素30μg/片、慶大霉素10μg/片、萘啶酸30μg/片、萬古霉素 30μg/片（直徑6mm）均購自中國藥品生物制品檢定所，符合CLSI標準；SDS、EB、氯霉素、氨芐青霉素 美國Sigma公司；質粒提取試劑盒、PCR Mix、100bp Ladder Marker 北京天根試劑公司；λHindⅢ Marker、HB101 上海寶生物公司；溶菌酶 Biotech公司。

表1 實驗菌株Table 1 Strains for experiment

GL-20G-II型冷凍離心機、TGL-16G型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；XSZ-G型光電顯微鏡 重慶光學儀器廠；SPX-150B型生化培養箱 上海博訊實業有限公司；BTS-20M型凝膠成像系統、TGradient Thermocycler 96型PCR儀 德國Biometra公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 K-B法檢測乳桿菌的耐藥性 參考管遠志等[9]的方法。待測菌在MRS培養基（蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫80 1.0mL/L，乙酸鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，硫酸鎂0.58g/L，硫酸錳0.25g/L，pH6.2±0.2）中，37℃培養16h后，以無菌生理鹽水稀釋至0.5麥氏標準濁度（菌體濃度約為5×108CFU/mL）。取該菌液1mL入滅菌平皿中，將融化的MH固體培養基（牛肉膏6.25g/L；酪蛋白胨17.5g/L；可溶性淀粉1.5g/L；瓊脂1.3%；pH7.2±0.2，）約20mL倒入平皿，混勻。待培養基凝固后，室溫放置3～5min，用鑷子將藥敏紙片貼放在平皿上，輕壓使緊貼瓊脂表面，靜置5min，置于37℃培養箱內，恒溫培養16～18h。量取抑菌圈直徑，并記錄結果。以標準敏感菌株大腸桿菌ATCC25922為質控菌，操作同上。受試菌株對多種抗生素的敏感性參照國際現行的臨床實驗室標準化協會CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實驗執行標準》第十九版信息增刊提供的紙片法標準進行判定（見表2）[10]。報告該受試菌對該抗生素是敏感（susceptible，S）、耐藥（resistant，R）、還是中介（intermediate，I）。

表2 K-B法藥敏實驗紙片含藥量和判斷標準Table 2 Antibiotic susceptibility testing paper concentration and interpretation standards of K-B method

1.2.2 質粒提取及檢測 取培養過夜的菌液10mL于離心管中，10000r/min離心5min，棄去上清，向沉淀中加入10mg/mL溶菌酶（以pH8.0，10mmol/L的Tris-HCl配制）500μL，搖勻，37℃水浴45min。采用質粒提取試劑盒，對待測菌株質粒進行提取，并進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，以λHindⅢ為標準分子量Marker。

1.2.3 質粒消除

1.2.3.1 SDS法 將待測菌株以2%的接種量接至含有不同濃度SDS的滅菌MRS培養基中（SDS濃度分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）[11]，37℃恒溫培養12代，每代24h，以質粒消除前菌株為對照，分別進行質粒提取，并對消除后的菌株進行抗生素敏感性檢測。

表3 抗性基因的引物序列Table 3 The primer sequences of resistance genes

1.2.3.2 SDS-高溫法 將待測菌株以2%的接種量接至含有不同濃度SDS的滅菌MRS培養基中（SDS濃度分別為0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%），37℃恒溫培養24h，再以2%的接種量轉入滅菌MRS培養基中，42℃恒溫培養24h，此為一個循環[12]，重復2～3次，以質粒消除前菌株為對照，分別進行質粒提取，并對消除后的菌株進行抗生素敏感性檢測。

1.2.4 抗性基因的檢測 在NCBI中查到質粒上的β-內酰胺類抗性基因blr、ECP-1569、nps-1，以及氯霉素抗性基因cmlA、cat、cmlA1，在Genbank中下載其全序列，設計引物，序列見表3，委托三博遠志公司合成。

以待測菌株的質粒DNA為模板，進行PCR反應。反應程序為：94℃預變性4min，94℃變性30s，相應溫度退火30s，72℃延伸1min，34次循環，72℃延伸10min。反應產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳（80～120V，30min），觀察產物電泳帶及其位置，按照100bp Ladder Marker確定擴增產物的大小。委托寶生物工程（大連）有限公司對PCR產物進行回收、測序。

2 結果與分析

2.1 待測菌株的抗生素敏感性

采用K-B藥敏紙片法檢測5株乳桿菌對13種抗生素的敏感性，記錄抗生素對供試菌株的抑菌圈直徑，結果見表4。

按照CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實驗執行標準》提供的紙片法標準進行判定，結果如表5所示。據表5可知，待測的5株乳桿菌對萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸具有普遍的抗性，耐藥率達100%，而主要對四環素敏感，其中，嗜酸乳桿菌LL對11種抗生素（除青霉素G、利福平外）表現出較普遍的抗性。

2.2 抗性菌株的質粒提取

表4 抗生素對待測菌株的抑菌圈直徑（mm）Table 4 Inhibition zone diameter of antibiotics to the tested strains（mm）

注：表中抑菌圈直徑為7，則表示紙片周圍沒有出現透明圈。

表5 待測乳桿菌對13種抗生素的敏感性Table 5 Antibiotic susceptibility of 13 antibiotics to the tested Lactobacillus strains

采用質粒提取試劑盒對待測乳桿菌的質粒進行提取，結果如圖1所示。

圖1 乳桿菌中的質粒Fig.1 Plasmid in Lactobacillus strains

由圖1可見，戊糖乳桿菌CH8的電泳圖顯示有6條質粒DNA條帶，其中一條大于23kb。戊糖乳桿菌Lp-A顯示有兩條質粒DNA條帶，分別為10kb、5kb左右。嗜酸乳桿菌LL和植物乳桿菌L11分別顯示有2條和4條質粒DNA條帶，均含有一條10kb左右的質粒條帶。瑞士乳桿菌LLB的電泳圖僅顯示一條10kb左右的質粒DNA條帶。乳酸菌中普遍存在著質粒，至少25種乳桿菌具有固有質粒，而且一種菌有多個質粒，質粒大小一般在1.9～84.8kb，絕大多數的質粒小于20kb[13]。Gevers等（2003）對風干香腸中的乳桿菌進行檢測，發現這些乳桿菌均具有10kb左右的質粒，且在這些質粒上攜帶了四環素耐藥基因tetM[14]。

在細菌的傳代過程中，某些質粒可能會從細胞中消失，但大多數的質粒是穩定存在的。本研究也對傳代30代后上述乳桿菌菌株的質粒進行了檢測，結果證明了其質粒的穩定性。

2.3 質粒消除

耐藥質粒的存在是細菌耐藥性的一個主要原因，因此質粒消除是耐藥性消除的一種重要方法。質粒消除便于觀察比較消除前后菌體表型的變化，從而得出質粒的遺傳功能，在對于質粒所含基因的研究中具有重要意義。

2.3.1 SDS法消除質粒

2.3.1.1 消除前后的質粒變化 采用濃度為0.05%～0.25%的SDS分別處理供試菌株，在SDS濃度為0.15%、0.2%和0.25%時，上述菌株均不能存活；濃度為0.1%時戊糖乳桿菌Lp-A和植物乳桿菌L11不能存活。因此選擇SDS處理后存活的菌株進行質粒檢測，結果如圖2～圖6所示。

結果表明，SDS濃度為0.05%時，植物乳桿菌L11的四條質粒（在1～10kb不等）被完全消除（見圖4，泳道2），戊糖乳桿菌CH8的質粒沒有被消除。當SDS濃度增加到0.1%時，戊糖乳桿菌CH8的6條質粒丟失了5條，包括一條大于23kb的質粒及2kb到10kb間大小不等的4條質粒，一條15kb左右的質粒沒有被消除（見圖2，泳道3）。而嗜酸乳桿菌LL（見圖3）、戊糖乳桿菌Lp-A（見圖6）和瑞士乳桿菌LLB（見圖5）的質粒均未被消除。由此可見，用SDS消除乳桿菌質粒的效果不顯著，與之前的相關報道不相符[15]。

圖2 SDS法消除戊糖乳桿菌CH8質粒Fig.2 Plasmid eliminate results of L.pentosus CH8 by SDS method

圖3 SDS法消除嗜酸乳桿菌LL質粒Fig.3 Plasmid eliminate results of L.acidophilus LL by SDS method

圖4 SDS法消除植物乳桿菌L11質粒Fig.4 Plasmid eliminate results of L.plantarum L11 by SDS method

圖5 SDS法消除瑞士乳桿菌LLB質粒Fig.5 Plasmid eliminate results of L.helveticus LLB by SDS method

圖6 SDS法消除戊糖乳桿菌Lp-A質粒Fig.6 Plasmid eliminate results of L.pentosus Lp-A by SDS method

2.3.1.2 消除質粒后菌株抗生素敏感性的變化 采用K-B藥敏紙片法檢測質粒消除后的CH8和L11菌株對抗生素的敏感性，結果見表6。由表6可知，戊糖乳桿菌CH8質粒消除前后，其抗生素敏感性發生了部分變化。質粒消除前，CH8菌株對氯霉素和頭孢噻吩均表現出抗性，而消除后對這兩種抗生素均表現出敏感，對其他11種抗生素的敏感性沒有變化。可見，消除的質粒上可能含有抗氯霉素和頭孢噻吩的抗性基因。而植物乳桿菌L11消除了全部質粒后，與消除前相比，其抗生素敏感性沒有變化，這也初步表明，植物乳桿菌L11的質粒上不含有所試抗生素的抗性基因，或者在質粒和基因組上同時含有所試抗生素的抗性基因。

2.3.2 SDS-高溫法消除質粒

2.3.2.1 消除前后的質粒變化 采用濃度0.01%～0.03%的SDS分別處理供試菌株，并進行高溫培養。在SDS濃度為0.01%、0.015%和0.02%時，上述乳桿菌均存活，但只有CH8的質粒被部分消除，且消除效果并不隨濃度的增加而改變，濃度為0.025%、0.03%時，CH8和部分菌株不能存活，仍具有存活能力的菌株，其消除效果不隨SDS濃度的增加而改善。因此選擇SDS-高溫處理后存活菌株進行質粒檢測，結果如圖7～圖11所示。

結果表明，嗜酸乳桿菌LL（見圖8）、戊糖乳桿菌Lp-A（見圖9）、瑞士乳桿菌LLB（見圖10）和植物乳桿菌L11（見圖11）在SDS-高溫處理后質粒并沒有被消除，而戊糖乳桿菌CH8的6條質粒中丟失了5條（見圖7，泳道1、2、3），被部分消除。

圖7 SDS-高溫法對消除戊糖乳桿菌CH8質粒Fig.7 Plasmid eliminate results of L.pentosus CH8 by SDS-high temperature method

圖8 SDS-高溫法消除嗜酸乳桿菌LL質粒Fig.8 Plasmid eliminate results of L.acidophilus LL by SDS-high temperature method

圖9 SDS-高溫法消除戊糖乳桿菌Lp-A質粒Fig.9 Plasmid eliminate results of L.pentosus Lp-A by SDS-high temperature method

表6 質粒消除后抗生素敏感性的變化Table 6 Antibiotic sensitivity of the tested strains after eliminated the plasmids

圖10 SDS-高溫法消除瑞士乳桿菌LLB質粒Fig.10 Plasmid eliminate results of L.helveticus LLB by SDS-high temperature method

圖11 SDS-高溫法消除植物乳桿菌L11質粒Fig.11 Plasmid eliminate results of L.plantarum L11 by SDS-high temperature method

2.3.2.2 消除質粒后菌株抗生素敏感性的變化 采用K-B藥敏紙片法檢測質粒消除后戊糖乳桿菌CH8對13種抗生素的敏感性，結果見表7。由表7可見，CH8菌株進行質粒消除后其抗生素敏感性發生了部分變化。質粒消除前，CH8菌株對氯霉素和頭孢噻吩均表現出抗性，而質粒消除后菌株對這兩種抗生素均表現出敏感，對其他11種抗生素的敏感性沒有變化。該結果表明，消除的質粒上可能存在抗氯霉素和頭孢噻吩的抗性基因。

2.4 抗性基因的檢測

以戊糖乳桿菌CH8的質粒為模板，以表3中相應的序列為引物，進行PCR反應，結果如圖12所示。

由圖12可見，戊糖乳桿菌CH8的質粒上存在β-內酰胺類抗性基因blr，不含有其他抗性基因。對上述目的條帶進行回收、測序，并經DNAman aligment分析發現，該序列與目的序列僅在第43和64位點有兩個堿基的差異，很可能是由于菌株差異造成的。因此可以初步確定戊糖乳桿菌CH8的質粒上含有blr基因，且該基因是決定其頭孢噻吩抗性的基因。將該戊糖乳桿菌CH8菌株的質粒轉化大腸桿菌也進一步證實了這一點。然而，要確定blr基因位于CH8菌株的哪些質粒上還有待于進一步研究。

圖12 戊糖乳桿菌CH8質粒的PCR結果Fig.12 PCR result of L.pentosus CH8 plasmid

國內外常用的藥敏檢測方法都是通過細菌的表型來判斷其耐藥性，且對于抗性基因的研究多集中于致病菌。如果能在菌株抗生素抗性的表型與基因型之間建立聯系，就可能對該表型對應的基因進行定位，從而從分子水平對細菌的耐藥性進行深入分析。

目前，我國還少見由益生菌感染動物及人體的報道，也缺乏對其耐藥性及使用后的流行病學調查資料，對益生菌的安全性評價手段與國際水平還處在一定的差距。隨著越來越多的新菌種申報進入國內市場以，也附帶了不安全性的風險。因此，本研究方法可以為乳制品市場常用益生菌菌種的安全性進行風險評估，為建立適合國情的益生菌安全性評價體系提供技術依據。

3 結論

3.1 以大腸桿菌ATCC25922為質控菌株，對5株潛在益生乳桿菌的抗生素敏感性研究表明，菌株均對萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸表現出普遍的抗性，耐藥率達100%。

3.2 無論采用SDS還是SDS-高溫法消除質粒方法，僅對部分菌株中的某些質粒有效，即不同菌株之間，對于不同的質粒其消除方法的有效性存在著差異。

3.3 對消除質粒后的戊糖乳桿菌CH8抗生素敏感性的分析表明，CH8菌株的質粒上存在決定其頭孢噻吩抗性的基因blr，這在一定程度上反映出益生乳桿菌質粒抗生素抗性基因與其耐藥性間存在相關性。

表7 戊糖乳桿菌CH8質粒消除后抗生素敏感性的變化Table 7 Antibiotic sensitivity of L.pentosus CH8 after eliminated the plasmids

[1]Tanida M，Yamano T，Maedar，et al.Effects of intraduodenal injection of Lactobacillus johmsonii Lal on renal sympathetic nerve activity and blood pressure in urethane-anesthetized rats[J].Nearo Sci Lett，2005，389（2）：109-114.

[2]張灼陽，劉暢.乳酸菌耐藥性的研究進展[J].中國微生態學雜志，2007，19（5）：478-480.

[3]徐進，劉秀梅，楊寶蘭，等.中國常用益生菌菌種的耐藥性研究[J].衛生研究，2008，37（3）：354-356.

[4]張麗芳，田洪濤，張玉蘭，等.健康人體及保健品中乳酸菌和雙歧桿菌的抗藥性分析[J].中國食品學報，2009，9（6）：144-150.

[5]D’aimmo MR，Modesto M，Biavati B.Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp.isolated from dairy and pharmaceutical products[J].International Journal of Food Microbiology，2007，115：35-42.

[6]Toomey N，Bolton D，Fanning S.Characterisation and transferability of antibiotic resistance genes from lactic acid bacteria isolated from Irish pork and beef abattoirs[J].Research in Microbiology，2010，161（2）：127-135.

[7]Ana BF，Mohammed SA，Baltasar M.Identification of tet（M）in two Lactococcus lactis Strains isolated from a spanish traditional starter-free cheese made of raw milk and conjugative transfer of tetracycline resistance to lactococci and enterococci[J].Internationa Journal of Food Microbiology，2008，121：189-194.

[8]Louise F.Selective pressure affects transfer and establishment of a resistance plasmid in the L.plantarum gastrointestinal environment[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2008，61：845-852.

[9]管遠志，王艾琳，李堅.醫學微生物學實驗技術[M].北京：化學工業出版社，2006：105-119.

[10]M100-S19.抗菌藥物敏感性實驗執行標準-第十九版信息增刊[S].孫長貴，譯.2009，29（3）：34-38.

[11]婁愷，班睿，趙學明.細菌質粒的消除[J].微生物學通報，2002，29（5）：99-103.

[12]劉渠，白松濤.G+球菌及G-桿菌質粒消除方法研究[J].中國衛生檢驗雜志，1998，8（5）：275-278.

[13]Wang TF，Lee BH.Plasmids in Lactobacillus[J].Critical Reviews in Biotechnology，1997，17（3）：227-272.

[14]Gevers D，Danielsen M，Huys G，et al.Molecular characterization of tet（M）genes in Lactobacillus isolates from differenttypesoffermented dry sausage[J].Applied and Environmentai Microbiology，2003，69（2）：1270-1275.

[15]格日勒圖，張延超，王艷霞，等.幾種食用乳酸菌內源性質粒DNA的普查、消除及其穩定性實驗[J].中國乳品工業，2008，36（10）：4-7.