發酵鹽濃度對Chlorella vulgaris生物合成蛋白與油脂的影響

李昌靈，楊海麟，李宇佶，張 玲，王 武，*

（1.江南大學教育部工業微生物技術重點實驗室，江蘇無錫214122；2.懷化學院生命科學系，湖南懷化418008）

普通小球藻屬綠藻門（Chlorophyta），小球藻屬（Chlorolla），是一類普生性單細胞微藻[1]。小球藻廣泛分布于淡水和海水中，除利用光能和無機碳（如，CO2和碳酸鹽等）進行光合自養以外，還可利用一種或多種有機物作為能源和碳源在黑暗中生長[2]，即進行異養發酵。小球藻富含油脂、蛋白質、碳水化合物、維生素、食用纖維、微量元素和其他生物活性物質[3]，具有降血壓、降血脂，抗動脈粥樣硬化，增強免疫力，抗腫瘤以及抗病毒感染等保健功能[4]。海水的鹽度約在35，但是近海的淡水稀釋或蒸發等導致海水的鹽度發生變化（鹽度范圍在10～70）[5]。鹽度變化引起的滲透壓對海藻產生氧化脅迫[6]。大量研究表明：在生長和光合作用過程中，大型藻類會對其產生影響的單個或多環境因素（如，溫度，光照、pH、營養及鹽度）協同作用產生生理響應[7-11]。海洋植物對不利的過多活性氧（如，過氧化氫、單態氧、超氧自由基和羥基等）能快速做出響應，并在細胞內產生一些物質進行中和[12]，并且為了適應滲透壓脅迫產生一些生理反應，如產生一些抗氧化和生理調節物質（包括可溶性蛋白、脯氨酸、脂質和脂肪酸等），通過這些生理功能和相應的行為來調節對細胞產生毒害的滲透壓，離子失衡和氧化作用[12-15]。低滲或高滲均能影響細胞外部的電勢和細胞內的膨壓、離子分布和有機質的溶解度，過高或過低的滲透壓會影響細胞的分裂和生長[16]。通過增加細胞膜上脂肪酸飽和度可產生更致密的脂質雙分子層以減少小分子滲透[6]。鹽度同樣能對單細胞海藻產生脅迫作用[17-18]，如：破壞光合色素，阻礙氮磷等營養的利用，抑制藻細胞的分裂與生長導致細胞氧化而死亡等，影響小球藻工業化生產。本研究主要研究發酵過程中鹽度對小球藻細胞生長、蛋白質、部分氨基酸以及油脂合成的影響，以探索通過改變鹽濃度調控小球藻胞內組分的實現手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻藻株Chlorella vugaris C9-JN2010 本實驗室從海水中分離并經過人工選育獲得，保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心（菌種保藏登記號為CCTCC M 2010373）；種子培養基 BG11培養基[19]（單位mg/L），NaNO31500，MgSO4·7H2O 75，CaCl2·2H2O 36，檸檬酸6，Na2EDTA 1，檸檬酸鐵銨 6，Na2CO320，K2HPO440；微量元素（A5）：ZnSO4·7H2O 0.222，CuSO4·7H2O 0.079，MnCl2·4H2O 1.81，Na2MoO4·2H2O 39，Co（NO3）2·6H2O 0.049，H3BO32.86；發酵培養基修改BG11培養基：NaNO3和K2HPO4分別為350.0和25.0mg/L，其余成分不變；Nile red Sigma-Aldrich公司；過硫酸鉀 愛建德固賽（上海）引發劑有限公司；其余分析用藥品為分析純 上海國藥集團。

YXQ-LS-50S1型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ZHWY200B型搖床上海智城分析儀器制造有限公司；DHP-2000型電熱恒溫培養箱 天津市華北實驗有限公司；水平層流凈化工作臺 蘇州潔凈技術研究所；分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；F-4600型熒光分光光度計、U3900型紫外分光光度計 日立公司；Digestion Unit K-424、Digestion Unit K-35 瑞士BUCHI公司；Digital BuretteⅢ 德國普蘭德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養 挑取固體平板上培養的藻株至含有1mL dd H2O的2mL離心管中，混合物用槍頭吹打均勻。分別取適量接種于含有50mL BG11液體培養基的100mL三角瓶中，置于恒溫光照搖床中振蕩培養，培養條件為：光照周期為16h：8h，溫度為25℃，pH 7.0，通氣流量為0.1vvm，光照強度4000lux的培養條件下培養4d。

1.2.2 鹽度實驗 以標準BG11培養基培養處于對數生長期的小球藻種子液，分別接種于NaCl濃度為0%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%裝有400mL培養基的500mL反應瓶中，調整初始pH為7.0，初始接種濃度為吸光值0.5±0.05（D680nm），折合干重約（0.150 ±0.015）g/L，于溫度為（25±1）℃，光強為4000lux，光暗周期為16h：8h條件下，連續通氣（氣流量為0.1vvm，由底部通入）培養6d。

1.2.3 生物量和生長速率測定 培養至一定濃度后取樣，用滅菌雙蒸水進行10倍濃度梯度稀釋，用紫外-可見分光光度儀測定680nm波長處各稀釋樣品的吸光值，同時取各稀釋樣品于8000r/min離心10min后，洗滌并將沉淀藻體在80℃恒溫干燥至恒重后測定藻體干重，并制作標準曲線。培養期間每12h取樣一次，用紫外-可見分光光度儀測定680nm波長處的吸光值，并建立回歸方程見式1，根據式1計算藻生物量；平均比生長速率見式2。

其中：X1是第一次取樣時（t1）的生物量，X2是第二次取樣時（t2）的生物量。

1.2.4 總氮及總磷檢測 小球藻培養液于10000r/min離心5min后，收集上清液用于總氮（TN）及總磷（TP）含量測定。總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB 11894-89，水質總氮的測定）；總磷采用過硫酸鉀氧化-鉬酸銨分光光度法測定（GB 11893-89，水質總磷的測定）。

1.2.5 生理參數的檢測 葉綠素含量的檢測以95%的乙醇提取采用分光光度法檢測[20]。蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法[21]，蛋白質含量（mg/L）=氮含量（mg/L）×6.38。游離脯氨酸測定參照文獻[22]的方法。油脂含量采用修改的Nile red法[23]，油脂含量（μg/mL）=0.496X+0.178（R2=0.991）。

1.2.6 數據分析方法 數據采用軟件origin進行統計分析，每個實驗重復3次，實驗所得值為平均值±標準偏差。

2 結果與討論

2.1 鹽度對小球藻的生長的影響

小球藻培養在不同NaCl濃度培養基中，NaCl濃度對其生長產生影響，結果見圖1、圖2。小球藻C9-JN2010在淡水中生長最佳，其生物量、平均比生長速率及生產效率均最高，分別為0.750g·L-1、0.225d-1和0.125g·L-1·d-1。根據圖1可知，小球藻在0～96h生長速度較慢；在96～144h進入對數期生長較快。由圖2可知，隨著鹽濃度升高，鹽對生長的抑制越顯著。當鹽濃度在0%～2.5%，小球藻可較好地生長，而鹽濃度達到5.5%或以上，藻細胞生長幾乎停止而死亡。鹽度導致植物細胞生長受抑或死亡的主要原因有細胞外部環境的滲透壓過大，導致細胞大量失水及干擾細胞膜上的電荷及pH等[6，16]。另外，由于滲透壓的脅迫，引起細胞內產生過多的活性氧化物對細胞產生毒害作用，也可導致細胞死亡[17-18]。

圖1 不同NaCl濃度下小球藻的生長曲線Fig.1 The growth curves of Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

圖2 不同NaCl濃度下小球藻生物量和平均比生長速率Fig.2 Productivity and mean specific growth rate of Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

2.2 藻細胞中光合色素的變化

培養在不同NaCl濃度的小球藻C9-JN2010，藻細胞內光合色素發生變化（圖3）。在0%～1.5%鹽濃度范圍內，光合色素的含量隨著藻細胞生長增加，至96h達到最高值，分別為39.50、32.80mg·g-1。隨后，色素含量開始下降。當鹽度為2.5%，培養至48h光合色素含量與24h相比稍微降低，96h又上升至19.30mg·g-1，與剛開始接種細胞相當，隨后又開始降低。這可能是因為藻細胞在前對鹽度有一定的適應期，并對產生的脅迫進行響應。而在3.5%～5.5%NaCl濃度，隨著藻細胞的生長，光合色素含量在不斷的降低，至96h已達到最低分別為4.10、2.30、1.10mg·g-1。總之，隨著鹽濃度的升高，小球藻細胞內光合色素含量不斷降低，這與Singh等[24]報道的結果一致。Lu等[25]認為由于光合系統PⅡ對NaCl敏感，導致氧的釋放及二氧化碳固定受抑制，且光合色素對鹽度的敏感比對細胞生長更強。另外，光合色素的合成需要大量的氮，若氮經過葉綠體光呼吸電子傳遞鏈進行利用受阻，導致藻細胞對氮的利用受抑制影響細胞的分裂與生長[17]。

圖3 NaCl濃度對小球藻胞內光合色素含量的影響Fig.3 Content of chlorophyll in the algal cell cultivated in different concentration of NaCl

2.3 鹽度影響小球藻對N、P的利用效率

圖4 不同NaCl濃度下小球藻對氮磷的利用效果Fig.4 Results of consumption of nitrogen and phosphorus by Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

培養在不同NaCl濃度的小球藻C9-JN2010，在停留時間為144h內，隨著生長的進行，對氮磷的消耗在不斷增加，見圖4a、4c。小球藻在前96h，由于生長速度較慢，對氮磷的利用速度也較慢。而在96～144h藻細胞增長速度加快，其氮磷的消耗也加快。由圖4b和圖4d可知，在無NaCl條件下，小球藻對氮磷的消耗效果最好，培養至144h，培養基中的氮磷濃度分別為3.00、0.23mg·L-1，其氮磷利用率分別為96.4%、93.5%，消耗強度分別達到9.10、0.71mg·L-1·d-1。隨著NaCl濃度的增加，小球藻的生長受到不同程度的抑制，導致氮磷的利用效率降低。尤其在5.5%NaCl濃度時，藻細胞對氮磷的利用效率很低，培養基中殘留的氮磷濃度很高，分別為53.80、4.30mg·L-1，其氮磷利用率僅為3.9%、4.4%；其消耗強度分別0.50、0.04mg·L-1·d-1。這是因為光合色素受到破壞，細胞生長受到抑制，導致其對氮磷等營養的攝取受阻。

2.4 鹽度對蛋白質及游離脯氨酸含量的影響

小球藻C9-JN2010培養在不同NaCl濃度，停留時間為144h，考察NaCl濃度對蛋白和游離脯氨酸合成的影響（圖5、圖6）。由圖5可知，培養至144h，高鹽度影響藻細胞的蛋白合成，低NaCl濃度藻細胞的蛋白含量高，而隨著鹽濃度增加藻細胞的蛋白含量相應降低。在無鹽培養基中藻蛋白含量最高為55.0%（W），細胞蛋白質生產效率為68.40mg·L-1·d-1，而在5.5%NaCl中蛋白含量最低僅為37.4%，蛋白質生產效率為13.80mg·L-1·d-1。本研究發現藻在低鹽度培養蛋白含量高，與Richmond等[26-27]報道的結果一致。

鹽度同樣影響細胞內氨基酸的合成，尤其對游離脯氨酸的影響非常顯著，見圖6。在無鹽（0%）和高鹽濃度（3.5%～5.5%）下，脯氨酸隨著藻細胞生長而增長較慢，在48h脯氨酸含量達到最高值，且均較低，約為0.10%～0.17%。在無NaCl時，脯氨酸含量最低僅為0.1%左右。而在1.5%和2.5%NaCl濃度時，脯氨酸隨著藻細胞生長而增長較快，分別在48、96h達到最高，為1.55%（W）、2.25%（W），隨后開始下降。主要原因可能是藻細胞適應了低鹽度環境后，以脯氨酸作為氮源和能源物質加以利用而繼續生長，導致細胞內其含量在后期開始下降。脯氨酸含量最高與最低之比超過20.0倍。有關鹽度對小球藻中脯氨酸含量的影響報道較少，為目前報道的最高比值。該藻在2.5%NaCl濃度時脯氨酸積累最多，鹽度過高或過低都影響脯氨酸的積累。Gzik[28]利用不同濃度NaCl處理甜菜發現葉子中脯氨酸含量在4.0mol/L NaCl濃度最高，且是對照的12.0倍左右。鹽脅迫小球藻通過Glu途徑積累脯氨酸的含量除取決于活性上升外，Kalinina等證實鹽脅迫下海水小球藻胞內脯氨酸迅速積累還與光呼吸乙醇酸途徑的激活和Glu脫氫酶的活化有關。曾有報道，許多植物在鹽脅迫下，細胞內脯氨酸大量積累。其除作為細胞質內滲透調節物質外，在穩定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒和能量庫調節細胞氧化還原勢等起重要作用[29]。Kiyosue等[30]研究了鹽脅迫下的擬南芥葉和根中脯氨酸合成關鍵酶基因，發現P5CR基因的轉錄的mRNA提高了5.0倍和2.0倍，P5CS基因mRNA水平提高十倍以上。關于微生物的鹽脅迫下胞內脯氨酸積累的報道較少。另有報道，高鹽處理某些耐鹽藻類并沒有明顯提高胞內脯氨酸含量[31]。可能這些耐鹽藻以其他的生理物質來調節滲透壓。也有研究發現，在低鹽和高鹽條件下Ulva pertusa和G.tenuistipitata均能大量積累脯氨酸[32-33]。可能不同藻種具有不同生理特性，對抗鹽脅迫所需的生理物質不同而導致了此種差異。

圖5 不同NaCl濃度處理小球藻C9-JN2010細胞的蛋白含量及生產效率Fig.5 Content and productivity of protein from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

圖6 不同NaCl濃度處理的小球藻C9-JN2010細胞脯氨酸含量Fig.6 Content of proline from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

2.5 鹽度對油脂含量的影響

圖7 小球藻C9-JN2010在不同NaCl濃度處理的細胞油脂含量Fig.7 Content of lipid from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

小球藻C9-JN2010培養在不同NaCl濃度，停留時間為144h，發現NaCl濃度對油脂合成有顯著影響（圖7）。在0.0%～2.5%NaCl濃度，隨著鹽濃度的升高，藻細胞內油脂含量明顯上升（4.2%～15.5%），且在2.5%NaCl濃度時，油脂含量最高達到15.5%（W），其生產效率為16.10mg·L-1·d-1。而當NaCl濃度超過2.5%時，藻細胞內油脂含量則隨著鹽濃度的升高不斷降低。在未添加NaCl的培養基中，藻細胞內油脂含量最低僅為4.2%（W），其生產效率也最低為3.33mg·L-1·d-1（圖7）。藻細胞油脂最高與最低值之比約3.6。適當增加鹽度有利于藻油脂的積累[34-35]，本研究也支持其觀點。Harwatia等[36]報道0.0%～2.0%鹽度處理熱帶淡水藻Chlorococcum sp.，在2.0%鹽濃度處理下油脂含量最高，其油脂含量的最高與最低值之比約為3.0。鹽處理植物能誘導細胞內總油脂的顯著增加[37]。

3 結論

在未加NaCl的培養基中小球藻C9-JN2010生長最佳，生物量、光合色素含量、比生長速率和生產效率均達最大為0.75g·L-1、39.50mg·g-1、0.225d-1和0.125g·L-1·d-1。藻蛋白含量最高為55.0%（W），其生產效率為68.40mg·L-1·d-1，且小球藻對氮磷的利用效率也高至96.4%及93.5%，其利用強度分別為9.10mg·L-1·d-1和0.71mg·L-1·d-1。

當藻細胞培養在2.5%NaCl濃度下，在96h脯氨酸含量達最高為2.25%（W），其最高（在2.5%NaCl）與最低值（在0.0%NaCl）之比約20.0倍。脯氨酸是該小球藻對鹽脅迫的重要調節物質。有關Chlorella vulgaris細胞中游離脯氨酸對鹽濃度的響應機理有待進一步研究。藻細胞內油脂含量在144h達最高為15.5%（W），其生產效率為16.10mg·L-1·d-1，油脂含量的最高與最低值之比約為3.6。

在耐鹽植物中，細胞內積累甘油酯往往與鹽度脅迫耐受力有關[38]。本研究表明，以獲取微藻蛋白質為目的，可通過低鹽度培養；以獲取脯氨酸為目的，則可提高鹽濃度至適中，大幅度提高胞內游離脯氨酸含量；5.0%鹽濃度下，則能提高微藻油脂含量甚至脂肪酸組成比例。發酵培養過程中可通過改變鹽濃度調控微藻生理代謝支流，以達到增強胞內主要營養組分合成的目的。

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