潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌中AOM/DSS模型應用研究

吳 瓊，郭 蒙，葉 華，朱宇珍，鄭學寶

（1.廣東醫學院藥理教研室，廣東 湛江 524023；2.廣東醫學院廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是世界第三大常見惡性腫瘤，CRC可由自發或慢性炎癥發展而致。炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是CRC發生除吸煙、飲食、家族遺傳等因素外的一個致病因素，可以大大增加患CRC的風險[1]。慢性炎癥的反復損傷、修復、增生、引起基因突變，從而引起細胞癌變，大約有20%的人癌癥來源于慢性炎癥[2]。結腸炎相關性結直腸癌(Ulcerative colitis associated colorectal cancer，UCACRC)動物模型的研究，有助于探索復雜的CRC發病和發展的機制，動物模型已經為腫瘤轉移及特異性靈敏療法提供了依據[3]，所以以人類診斷和治療為導向的試驗必須用動物模型做臨床前研究。目前最常用的化學誘導IBD相關性CRC癌變的動物模型中，氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)誘發的CRC動物模型可以成功模擬其全過程。本文主要探討AOM/DSS動物模型的造模方法及UC相關CRC組織學特征，并探討其主要特點以及診斷癌變途徑的研究進展。

1 AOM/DSS動物模型

CRC的發生發展是一個長期的過程，正常上皮細胞通過隱窩異常發展為腺瘤進而發展為原位癌。CRC模型已經可以模擬人類的腫瘤病因和病理學改變，無論是體內還是體外模型均可以反映CRC發展的每一個階段。AOM/DSS模型是使用最廣泛的小鼠模型，AOM是一種化學致癌劑1,2-二甲基肼(1,2-dime-thylhydrazin，DMH)作用的DNA烷基化產物，可以由腹腔注射并經由膽汁代謝，由菌群代謝進一步激活AOM使其致癌[4]，AOM較DMH相比致癌效果增強且更加穩定。多次腹腔注射AOM導致在結腸遠端產生腫瘤，其組織學特征類似于人類的CRC，要模擬CRC需要AOM與DSS結合造模。DSS為化學致炎劑，動物飲用含有DSS的飲水可以造成炎癥性腸病模型，其病理學改變類似于人類潰瘍性結腸炎。

AOM/DSS模型多應用于CRC發病機理的研究、預防CRC化學藥物的研究、致癌環境的檢測[5]以及腫瘤轉移風險研究[6]。實驗性結直腸癌的發生主要是由AOM/DSS模型誘發的異常隱窩病灶(Aberrant crypt foci，ACF)和腺瘤癌變形成，均依賴于劑量、誘導方式、誘導周期、根據不同的延長時間形成癌變[7]。Suzuki等[8]報道，選用 Balb/c、C2H/HeN、C57BL/6N、DBA/2N四種品系小鼠，在造模第一天給予單次腹腔注射AOM(10 mg/kg)，第二天給予含有1%的DSS自由飲用5 d，之后不做任何處理，至到實驗第126天結束實驗，觀察到AOM/DSS模型在不同品系小鼠中結腸癌的發生敏感性存在差異；在4個近交系小鼠進行造模研究，其中結腸腺癌發生率在Balb/c小鼠中為100%，在C57BL/6N小鼠中為50%，在C3H/HeN小鼠中為29%，在DBA/2N小鼠中為20%。

AOM/DSS模型通過炎癥和免疫組化的硝基酪氨酸陽性表達陽性率判斷小鼠品系對其敏感度為：Balb/c＞C57BL/6N＞C3H/HeN＞DBA/2N。 最 近 研 究AOM/DSS模型造模方法相關報道如表1[8-15]。Tian等[12]和Shang等[13]報道，AOM/DSS模型可以導致其結腸腺癌發生率接近100%。

表1 AOM/DSS模型方法

2 在炎癥相關癌癥研究中AOM/DSS模型的應用

腫瘤發生是一個復雜的過程，包括啟動、促進和發展。細胞癌變涉及到腫瘤細胞的變異、侵襲及增殖。促進腫瘤形成需要持續誘導和刺激，以及早期致癌物質對凋亡的抑制。在腫瘤形成初期，隨著癌細胞增殖成纖維細胞也會轉移到病灶處，發揮有益功能的細胞開始倒轉過來對抗機體，通過刺激炎癥而促進腫瘤生長[16]。炎癥微環境可以影響腫瘤的發生和腫瘤形成[17]，從臨床前研究和臨床研究通過潛在分子機制已經證明炎癥持續發生會導致腫瘤的發生，是發生癌變的高危因素[18]。流行病學研究顯示，包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)的炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)發生癌變的機制為：發炎黏膜增生性病變-不典型增生-癌變[19]。由炎癥誘發的癌變機制包括：炎癥誘導活性氧和活性氮產生、誘導的基因組不穩定、基因突變后的倍性、增強細胞增殖、基因異常表達、抗凋亡、腫瘤的血管可以新生以至于更具侵略性、穿透基底膜導致腫瘤轉移。這些機制可以直接或是間接的通過損傷重要的細胞成分(例如DNA、蛋白質和脂質)，促進細胞惡性轉化。炎癥已經成為癌癥的第七大特征，慢性炎癥的持續刺激是多種腫瘤產生的關鍵原因。

AOM/DSS模型在炎癥相關結直腸癌實驗中具有重要意義，它是在腫瘤發生率相對較低的前提下，由標準的UC模型通過多周期DSS誘導和延長造模時間完善而制定。在AOM/DSS誘導3～4周后，小鼠結腸黏膜出現彌散性炎癥，上皮隱窩異常，固有層呈現不規則形態并有大量炎癥細胞表達(淋巴細胞，漿細胞)。研究中有大量肥大細胞遷移，可以發現其周圍或是在其內部有癌變[20]。觀察人類結腸炎相關性結腸癌的特征主要表現在免疫細胞浸潤，包括巨噬細胞、T細胞(包括CD8+、CD4+效應T細胞和CD4+、CD25+T細胞)[21]。Garrett等報道，樹突狀細胞為T-Bet(-/-)RAG2(-/-)UC模型中炎癥癌變的細胞感受器[22]。Mantovani等[23]報道，在AOM/DSS模型中形成腫瘤的第一階段，可以觀察到誘發癌癥的兩個條件——結腸炎和遺傳/后生遺傳在特定的微環境協調下，有助于促進腫瘤形成。在AOM/DSS模型中促進腫瘤生長的兩個條件，炎癥內在途徑為炎癥相關基因的表達促進腫瘤細胞基因改變，外在途徑為在腫瘤微環境中促進炎癥條件改變[23]。

在AOM/DSS模型中炎癥促癌發生關鍵因子包括主轉錄因子(例如NF-κB和STAT3)、炎性細胞因子(TNF-α，IL-6)、COX-2和特定趨化因子。用于檢查炎癥介質包括IL-10、TCF-β、toll樣受體(TLR)，IL-1受體抑制劑TIR8，趨化因子誘餌受體和清道夫受體D6。

3 在癌癥研究中AOM/DSS模型的應用

大量實驗已經證明AOM/DSS動物模型與人類CRC的發病機制相似。由于腫瘤誘導劑(AOM)和腫瘤促進劑(DSS)的協同反應。AOM/DSS模型較僅用AOM或DSS模型相比，可以呈現急性炎癥的最初階段和較短的潛伏期來再現CRC的發生機制。例如，嚙齒動物自由飲用DSS，廣泛應用于IBD模型，通過DSS誘導CRC需要長時間飲用或多周期飲用，并且腫瘤發病率較低。

Tanaka等[20]報道，AOM/DSS模型是給予Balb/c小鼠單次腹腔注射AOM(10 mg/kg)，自由飲用2%DSS一個循環，利用這種造模方法有多發性結腸腫瘤產生。DSS溶于飲水中其毒性作用于結腸上皮細胞，飲用DSS第一周其特征表現在小鼠體重減輕、血便。但是，這些現象在AOM/DSS誘導5周后，明顯減輕。這個模型中的癌癥發展密切反映人類腫瘤發展模式。小鼠給予AOM/DSS誘發的腫瘤準確的概括了被觀察到的人類CRC發病機制。例如，腫瘤多發于結腸遠端，這也是人類自發CRC的主要位置。腫瘤先由息肉狀成長，并且其病理學特征與人類CRC相似。但是，AOM誘導的腫瘤往往缺乏黏膜侵襲性[24]。通過微觀和宏觀技術分析淋巴結和其他外周器官可能為考慮用于腫瘤轉移相關的研究。

CRC發病是一個多因素多步驟的過程，這個過程是由正常隱窩形成ACF，隱窩裂變增殖形成微腺瘤，微腺瘤發展成肉眼可見腺瘤、腺瘤性息肉，最終癌變形成腺癌。因此，在形態和遺傳學研究，這個多步驟過程為腺瘤癌變順序[25]。在近交系Balb/c和遠交系ICR-1易感小鼠中，AOM/DSS模型能有效地高再現性這個多步驟腫瘤發生過程。雄性小鼠中，從開始致敏到12周，結腸黏膜潰瘍導致結腸炎，不典型增生，管狀腺瘤，有80%～100%小鼠出現3～10個肉眼可見腫瘤[26-27]。利用固定好的結腸切片，通過亞甲基藍染色可觀察到結腸黏膜表面的結腸隱窩是否異常。

Roncucci等[28]報道在AOM/DSS誘導的3～4周可以觀察到深染部分為偶然的，異常大的略凸起的“異常隱窩”。AOM/DSS誘導的腫瘤通常是由T淋巴細胞和其他免疫細胞浸潤結腸壁，腺瘤增生惡性癌變為腺癌。AOM/DSS誘導的小鼠結腸中部和遠端可觀察到腫瘤呈結節狀、息肉狀和絨毛狀。Ward等[29]報道，這些腫瘤是管狀腺瘤或中度分化管狀腺瘤。Tanaka等[20]報道，AOM/DSS誘導20周時，其管狀腺癌發生率為100%，多發性腺癌發生率為38%。顯微鏡下觀察，所形成的腫瘤特性是結腸上皮內形成的腫瘤，成瘤過程是從息肉的周邊和非增生結腸上皮開始低度增生，到形成腫瘤的中央部位和黏膜下層浸潤的高度增生。Pascal等[30]報道結腸黏膜發生的不典型增生多為輕度和重度不典型增生。輕度不典型增生，細胞核細長，排列較緊密，出現假復層，但細胞核極性正常，杯狀細胞正常或略有減少；中度不典型增生，細胞核更加細長，排列緊密，假復層增多，但細胞極性仍正常，杯狀細胞減少；重度不典型增生，細胞核增大，為圓形或卵圓形，核染色質變粗，并出現明顯核仁，排列緊密，出現共壁、篩網結構，或腺管上皮細胞增生，連接成網狀，核極性紊亂，存在眾多有絲分裂，杯狀細胞明顯減少。若出現上述重度不典型增生現象可以確定腺瘤已癌變，有時腺瘤的細胞和組織學還處在不典型增生階段時，但腫瘤組織已突破黏膜肌層向黏膜下層浸潤并向周圍纖維組織發展，也可以確定腺瘤已癌變。

4 展望

在過去的二十年中，CRC小鼠模型提供了IBD向CRC發展相關的病理組織學和分子學機制，有助于我們了解人類IBD向CRC發病的機制。在動物模型中，化學誘導CRC小鼠模型已被證明是非常有價值的，而其中AOM/DSS模型為更加穩定的重要工具。AOM/DSS模型表明在短時間內動物受影響且腫瘤發病率很高，可以預見和監測的腫瘤發展，可以再現人類CRC發生發展的過程。在AOM/DSS模型的平臺上，開發CRC的化學預防藥物，觀察其診斷、預后和預測指標，在臨床前應用是非常有價值的。將來對AOM/DSS模型進一步完善，在開發新的和更復雜的分子工具與遺傳學結合應用，可能讓我們來重新定義CRC相關疾病。利用該模型的完善，更有助于觀察及控制癌前病變研究。

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