番茄溫敏型核雄性不育系T-4花藥蛋白質含量、POD及EST同工酶的研究

國亞慧 于分弟 甘桂云 韋冠睦 王先裕，6* 杜永臣 桝田正治

（1廣西大學農學院，廣西南寧 530004；2廣西來賓合山市嶺南鎮人民政府，廣西來賓 546500；3廣西柳州市農業科學研究所，廣西柳州 545003；4中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京100081；5日本岡山大學，日本700－8530；6國家大宗蔬菜產業技術體系桂林綜合試驗站，廣西桂林 541004 ）

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）屬于茄科番茄屬（Lycopersicon），自花授粉作物。植物育性是由基因控制的生理過程、生化反應和形態構建的最終結果。物質代謝是植物生命活動的基礎，是植株間的生理生化差異的反映。在發育過程中正常發育的花藥和花粉會積累一些物質，如蛋白質、核酸、碳水化合物（可溶性糖和淀粉）和某些氨基酸等，而雄性不育系花藥或花粉則相對缺乏。夏濤和劉紀麟（1993）在研究玉米細胞質雄性不育系的物質代謝時，提出了“物質虧損”的概念，提出結構物質、營養物質、能量物質的虧損現象嚴重影響小孢子的發育。國內外已對水稻（孫谷疇 等，1997；張明永 等，1997）、油菜（蔣梁材和劉啟鑫，1994）、小麥（張愛民 等，1996；張花 等，1996）、大白菜（王淑華 等，1998）、辣椒（耿三省 等，1997）及甜菜（孫立險，1986）、榨菜（胡美華 等，2000）等作物的不育花粉（藥）或葉片中氨基酸、同工酶、蛋白質等生化物質的異常進行了研究，揭示了雄性不育的生化機理。

王保仁等（1980）、劉忠松（1987）發現湘矮A CMS（屬Pol CMS 胞質）不育系及相應保持系間過氧化物酶（POD）同工酶譜帶存在差異；陳松等（1995）研究認為油菜不育系及其同型保持系的EST同工酶譜帶也有差異，胞質基因的不同會導致基因產物酯酶（EST）的不同；林寶剛等（2005）對Pol CMS、陜2A CMS及其同一保持系陜2B 的種子進行EST、POD同工酶比較分析后發現，不育材料種子的EST、POD同工酶都與保持系具有較大差異。李殿榮（1986）報道，雜交油菜秦油2號及其親本植株不同營養器官的EST、POD同工酶酶譜間存在著差異。張子學等（2008）研究表明，辣椒不育系與保持系材料的POD同工酶活性及種類、EST同工酶酶帶在花藥不同發育時期存在差異，超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活性及種類無明顯差異。截至目前對番茄不育系同工酶的研究報道甚少。雄性不育系在番茄育種中扮演著重要的角色，不但省工、省力，少去了人工去雄的步驟，還能提高種子質量，減少假種子的混雜。本試驗主要對番茄溫敏型核雄性不育系T-4的蛋白質、POD及EST同工酶進行研究，探索該材料不育的機理，為更好地研究和利用不育系提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為溫敏型核雄性不育系T-4和對照First，是由日本岡山大學農學部作物繁殖研究室桝田正治教授提供。在日本，T-4為對照First經γ射線輻照后所得的變異突變體，當溫度達到某一范圍時，T-4可恢復部分育性，高于或低于該臨界溫度范圍則表現為雄性不育，臨界溫度為20 ℃（Masaharu MASUDA and Christopher O.OJIEWO．2006）。不同地區T-4核雄性不育性表現出不同的臨界溫度，即臨界溫度遷移現象。在廣西南寧地區，夜溫為20 ℃左右是T-4育性轉換的臨界溫度，夜溫高于臨界溫度時表現為不育，低于14 ℃時也表現為不育（王先裕 等，2011）。

1.2 試驗方法

材料于2010年8月在廣西大學玻璃溫室中育苗，兩片真葉時轉入人工培養箱中進行處理。共設3個處理，處理的溫度分別為晝28 ℃/夜24 ℃，晝28 ℃/夜18 ℃以及晝28 ℃/夜12 ℃，每天光照12 h（7：00～19：00），濕度為70%。每個處理4株，對照為First，3次重復。

采集當天開放的花朵，在-80 ℃下保存，用于蛋白質、POD及EST同工酶的測定分析。蛋白質用考馬斯亮藍G-250染色分光光度法測定；POD及EST同工酶采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法進行測定。

蛋白質提取測定：準確稱取約0.1 g番茄花藥，放入研缽中，加入2 mL蒸餾水在冰浴中研成勻漿，離心（4 000 r·min-1，10 min），將上清液倒入10 mL容量瓶，再向殘渣中加入2 mL蒸餾水，懸浮后再離心10 min，合并上清液，定容至刻度。

另取1支具塞試管，準確加入0.1 mL樣品提取液，再加入0.9 mL蒸餾水、5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2 min后，以標準曲線1號試管做參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度。根據所測樣品提取液的吸光度，在標準曲線上查得相應的蛋白質含量，計算樣品蛋白質含量。

花藥POD液、EST液的提取：稱量0.1 g花藥，放入研缽中，加入pH 8.3Tris-HCl和20%的蔗糖緩沖液，在低溫下研磨至勻漿，在4 000 r·min-1離心15 min。取上清液放入超低溫恒溫冰箱-20 ℃備用。

染色方法：POD同工酶采用聯苯胺染色法；EST同工酶用α-醋酸萘酯、β-醋酸萘酯及堅牢藍RR鹽染色液染色。計算相對遷移率（Rf）。

2 結果與分析

2.1 不同溫度處理下T-4與對照First花藥中蛋白質含量

從表1中可以看出，對照First在3個溫度處理下（夜溫分別為24 ℃、18 ℃及12 ℃時）的蛋白質含量分別為2.85、2.75 μg·g-1及2.84 μg·g-1，三者之間差異不顯著。T-4在晝28℃/夜24 ℃及晝28 ℃/夜12 ℃的處理下的蛋白質含量分別為1.67μg·g-1和1.43μg·g-1，顯著低于晝28℃/夜18℃處理；在晝28 ℃/夜18 ℃處理下T-4蛋白質含量與對照First差異不顯著。即T-4在不育溫度條件下（夜溫高于20℃或低于14℃）的蛋白質含量顯著低于可育溫度條件下的蛋白質含量，且顯著低于對照First。

表1 不同溫度處理下T-4與對照First花藥中蛋白質含量

2.2 不同溫度處理下T-4與對照First花藥POD及EST同工酶酶譜

從圖1可以看出，在3個溫度處理下對照First的POD同工酶酶譜無明顯差異。T-4在晝28℃/夜18 ℃的可育條件下的POD同工酶酶譜與對照First間無明顯差異。T-4在不育溫度條件下，即晝28 ℃/夜24℃和晝28 ℃/夜12℃時POD同工酶酶譜，較可育溫度條件下多了一條遷移率為0.143的譜帶P1。表明T-4在晝28 ℃/夜24℃和晝28 ℃/夜12℃不育溫度條件下花藥的POD同工酶譜帶與可育溫度處理存在差異。

從圖2可以看出，在晝28℃/夜18℃的可育條件下，T-4 的EST同工酶酶譜共出現了4條酶帶；在晝28℃/夜24℃和晝28℃/夜12℃不育條件下，出現6條酶帶。即可育溫度條件下的EST同工酶酶譜比不育溫度條件下少了遷移率分別為0.415及0.491的2條譜帶，分別以E3和E4表示。對照First在3個溫度處理下酶譜無明顯差異。可育溫度條件下T-4的EST同工酶酶譜與對照First無顯著差異。表明對溫敏型雄性不育系T-4進行不同溫度處理，EST同工酶的譜帶存在差異，可育溫度條件下同工酶的譜帶少于不育溫度處理。

綜上所述，在不同溫度處理下，T-4花藥中POD、EST同工酶酶譜有差異，不育溫度條件下的POD、EST同工酶均表現為有較多譜帶，而可育溫度條件下的譜帶則較少。

圖1 3個不同溫度處理下T-4與對照First花藥中POD同工酶酶譜

圖2 3個不同溫度處理下T-4與對照First花藥中EST同工酶酶譜

3 結論與討論

本試驗結果表明，在不育溫度條件下T-4的花藥中蛋白質含量顯著低于可育溫度條件下的蛋白質含量，且顯著低于對照First花藥中蛋白質含量；同工酶酶譜的分析顯示，T-4在不育溫度條件下花藥中的POD同工酶和EST同工酶譜帶數量均多于可育溫度處理。從試驗結果可推測，番茄花藥中蛋白質的含量高低及POD同工酶和EST同工酶的表達均對育性表現存在一定的影響。本試驗僅從花藥中蛋白質的角度對番茄育性表現進行了研究，為了更好地了解番茄雄性不育的發生機理，有待進行全方位地剖析，從而更好地利用番茄雄性不育系在育種中的優勢。探索簡易的操作方式來對番茄雄性不育系進行篩選是一大難題，目前僅僅從外觀形態和簡單的花粉萌發情況對雄性不育系的育性進行判定，存在很大的不穩定性和不準確性，為了進一步探索不育系的育性作用機理，本試驗從蛋白質水平上對其進行分析，有待從基因水平上對其進行定位。

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