高蛋白酶解及抗營養因子降解菌株的篩選

東北農業大學生命科學學院 王婧瑤 劉 威 曹蕾蕾 葉忠雪 王立群＊

黑龍江華森畜牧科技有限公司 張劉運 張日闊

豆粕作為一種質量穩定的植物蛋白源，因其供應充足，氨基酸組成合理，含有異黃酮、脂肪酸、礦物質等生物活性物質及營養成分，日漸受到人們的青睞（余龍江等，2003）。然而，豆粕卻有其自身的局限性。一方面，豆粕主要是由大分子蛋白構成，不能像小分子蛋白——寡肽和游離氨基酸被機體充分吸收。另一方面，豆粕中含有大量抗營養因子，特別是其中的胰蛋白酶抑制因子和植酸含量較較高，均可達到2%左右，這不僅降低動物機體對營養物質的利用，也其影響健康（游金明等，2006；石慧，2006）。本研究即以蛋白酶活力、酸溶蛋白、游離氨基酸以及胰蛋白酶抑制因子和植酸含量為指標，采用紫外線誘變的方法，通過發酵豆粕篩選出可提高其中小分子蛋白含量且降低抗營養因子作用的優良菌株，使得發酵后的豆粕更有利于動物的消化和吸收，從而提高其經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 菌株JY，由東北農業大學微生物實驗室保存。

1.1.2 培養基 脫脂奶粉瓊脂培養基：脫脂奶粉40 g、瓊脂20 g、水1000 mL。奶粉和瓊脂分開滅菌，121℃下滅菌15 min，降溫至80℃后混勻。脫脂奶粉瓊脂雙層平板：9 cm直徑的培養皿中注入融化的2%瓊脂10 mL，冷凝后再注入脫脂奶粉瓊脂培養基10 mL。液體種子培養基：牛肉膏5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、水1000 mL，121℃滅菌15 min。豆粕培養基：豆粕 40 g、糖蜜 1 mL、水 34 mL，均裝入 250 mL三角瓶，121℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株誘變條件確定 菌株JB在液體種子培養基中37℃培養了8 h即為出發菌株，滅菌水稀釋成10-6、10-7和10-8三個濃度梯度，各濃度分別涂布脫脂奶粉瓊脂雙層平板（試驗組），所涂平板垂直置于30 W紫外燈下，15 cm照距照射10、20、30、40、50、60、90 s和 120 s， 設相應無照射對照組，照后黑布包好，37℃培養24 h，計算致死率，以試驗組雙層平板上適宜的菌落密度（6～12個）確定出發菌株最佳稀釋濃度和照射時間。

1.2.2 菌株誘變及初篩 以上述條件為依據進行批量誘變，并以其培養后雙層平板上的菌落直徑（c）及透明圈直徑（h）之比 K 值（h/c）進行初篩，取K值大于4的菌落純培養，4℃保存備用。

1.2.3 菌株的復篩 初篩菌株于液體種子培養基37℃培養12 h活化用于復篩檢測。其中蛋白酶活力、酸溶蛋白含量和游離氨基酸含量為菌株蛋白酶解能力的測定指標；而胰蛋白酶抑制因子含量和植酸含量為菌株降解抗營養因子能力的測定指標。

一部分活化菌液經Folin酚法測定蛋白酶活力（黃秀梨等，2008）。另取活化菌液5 mL接種到裝有豆粕培養基的250 mL三角瓶中，37℃、72 h固態發酵，后進行檢測。測定指標及方法如下：（1）三氯乙酸沉淀法測酸溶蛋白含量 （朱平軍等，2011）；（2）以水合茚三酮法測游離氨基酸含量（何照范等，1998）；（3）以改進的 BAPNA 法測胰蛋白酶抑制因子含量（盧曉凌，2009）；（4）以三氯化鐵比色法測植酸含量（傅啟高等，1997）。以對出發菌的上述處理作為對照。

1.2.4 菌株鑒定 所獲優良菌株通過菌體、菌落特征和生理生化特征進行鑒定。

1.2.4 數據處理 試驗采用SPSS 13.0數據統計分析軟件進行一維方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。試驗結果均以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 菌株誘變條件 從表1可見，所試稀釋梯度在處理時間分別為40、30和20 s時，相應平板上菌落數分別為50、10和3，同時各致死率亦均為75%。紫外線誘變育種中，往往以致死率確定誘變劑量，且在70%~80%時誘變效果最好，所以若只考慮到紫外誘變的劑量要求，則所試3個稀釋梯度在照射時間40、30 s和20 s時完全符合（張克旭和陳寧，1998），但考慮到在9 cm直徑的平板上觀測菌落及其周圍蛋白水解透明圈的可操作性及準確性，所以本試驗在30 W紫外燈、照距15 cm的前提下，選擇稀釋梯度為10-7、菌落數為10及紫外線誘變時間為30 s的條件進行后續的菌種的批量誘變。

2.2 優良菌株誘變及初篩結果 經上述條件批量誘變后，共得到K值大于4的突變菌15株，命名為 JY1、JY2……JY15。

表1 不同誘變條件下平板上的菌落數/致死率%

2.3 優良菌株復篩結果 15株初篩菌株蛋白酶解能力和抗營養因子降解能力測定結果見表2和表3。

表2 初篩菌株蛋白酶活力及豆粕發酵后酸溶蛋白和游離氨基酸含量

表3 篩選后所獲菌株的抗營養因子含量測定結果mg/g

由表2可見，15株菌蛋白酶活的表觀測定值均較高， 尤其是菌株 JY15、JY13、JY11、JY14 和JY8與對照組的差值較大（P＜0.01）。說明這5株菌產蛋白酶能力較強。15株菌酸溶蛋白的表觀測定值均較高，尤其是菌株 JY15、JY3、JY14、JY2 和JY12極顯著高于對照組（P＜0.01）。酸溶蛋白一般是酶解天然大分子蛋白的產物，可以溶解在三氯乙酸中，分子質量均在10 kD以下，包括寡肽和游離氨基酸。這類酸溶蛋白在飼料中被動物機體的吸收率遠高于天然大分子蛋白。所以說飼料中酸溶蛋白含量的提高即意味著飼料營養價值的提高。 因此菌株 JY15、JY3、JY14、JY2 和 JY12 在飼料微生物發酵中更具有使用價值。15株菌游離氨基酸表觀測定值均較高，尤其是菌株JY2、JY9、JY11、JY12、JY13、JY14 和 JY15 的游離氨基酸表觀測定值極顯著高于對照組 （P＜0.01）。傳統的蛋白質消化、吸收理論認為，蛋白質在腸腔內由胰蛋白酶和糜蛋白酶作用生成游離氨基酸和寡肽（也稱小肽，含2～20個氨基酸殘基，常指含2～6個氨基酸殘基的寡肽），寡肽在肽酶的作用下完全被水解成游離氨基酸，并以游離氨基酸形式進入血液循環。所以傳統理論認為游離氨基酸的含量決定了飼料的營養價值。

綜合以上的結果，三個指標中均與對照組差異極顯著的菌株有JY14和JY15，選擇上述兩株進行抗營養因子降解能力的驗證。

由表3可見，JY14和JY15菌胰蛋白酶抑制因子含量與對照組比均達到差異極顯著水平（P＜0.01）。同時，JY15與 JY14相比，差異也極顯著（P＜0.01）。胰蛋白酶抑制因子一方面可與動物小腸液中胰蛋白酶結合成無活性的復合物，降低胰蛋白酶的活性，導致蛋白質消化利用率降低，造成外源氮損失；另一方面結合后胰蛋白酶大量補償性分泌，造成蛋白質的內源性消耗、氨基酸代謝不平衡，影響動物機體生長。胰蛋白酶抑制因子的本質是蛋白質，其降低原因是微生物分泌的酶系，尤其是一些蛋白酶，對胰蛋白酶抑制因子產生了一系列的作用，使之部分降解。

經統計分析發現，上述兩株菌植酸含量與對照組比均達到差異極顯著水平（P＜0.01）。同時，JY15與JY14相比，差異也極顯著（P＜0.01）。植酸在動物消化道的酸度條件下，會與二價金屬離子、帶正電的蛋白質、氨基酸發生反應，生成絡合物及復合物，它們不僅基團之間親和能力強，且其本身難溶解，不僅影響磷的利用率，同時還影響礦物質元素、蛋白質、氨基酸利用率，甚至對淀粉酶、脂肪酶的活性均有抑制作用。植酸是B族維生素的一種肌醇六磷酸酯，其降低的原因是微生物的大量繁殖將其消耗利用或產生的植酸酶使其含量下降。

2.4 菌株鑒定結果 該菌菌落呈扁平狀，菌落擴散、邊緣整齊，表面濕潤，光滑，較黏稠；革蘭氏染色陽性；芽孢為橢圓形，中生或側生。生理生化特征為：好氧菌，接觸酶反應為陽性。根據JY15菌株的形態和生理生化特征，并依據《微生物實驗手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）進行菌種鑒定，該菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

3 討論

3.1 菌株的紫外線誘變 本研究中10-7稀釋梯度下得到的10個菌落，在平板上表現為均勻分散、彼此獨立、透明圈清晰可見。當誘變時間短、稀釋倍數低時，誘變后平板上菌落雖然可計，但是透明圈相連，無法計算K值；而當誘變時間長、稀釋倍數高時，其上的菌落數目則太少、外環境的輕微影響極易導致平板上無菌落，因此也不適宜批量操作。

對于菌株紫外線誘變步驟，大多試驗研究均采用紫外線照射菌液，后吸取一定量涂布平板（鞠華偉等，2007；牛春華，2011）。然而實際操作卻發現此方法得到的菌落數目極其不穩定。原因有兩個：一是培養皿底凹凸不平；二是吸取誘變菌液的含菌量（菌個數）難以恒定。為此本研究中，巧妙的采用紫外線照射涂布菌液后的平板，而使得各平板上的菌落數穩定一致，便于批量操作，為紫外線誘變育種的照射環節開拓了一個簡便、易行的良好方法。

3.2 菌株發酵對原料中蛋白含量的影響 傳統理論認為蛋白質是為動物機體提供氨基酸的營養源，且只有游離氨基酸才可被動物機體吸收利用；而新的觀點則認為寡肽的吸收更具優越性，因其不僅具有高效吸收、低耗能等特點，又可避免游離氨基酸之間的吸收競爭，同時一定的寡肽和游離氨基酸比例也會促進動物的吸收作用，因此通過酸溶蛋白含量測定評估飼料蛋白的優劣便成為了現階段被廣泛推廣的方法。而本試驗采用檢測蛋白酶解能力的兩個指標：酸溶蛋白含量和游離氨基酸含量，兼顧了傳統理論，將新舊觀點做了最大限度的平衡。

4 小結

本試驗獲得的菌株JY15發酵豆粕可提高其小分子蛋白含量，同時也降低了抗營養因子水平（P ＜ 0.01）。

[1]傅啟高，李慧荃.三氯化鐵比色法測定植酸含量的研究 [J].Acta Nutrimenta Sinica，1997，19（2）：216 ～ 220.

[2]何照范，張迪清.保健食品化學及其檢測技術[M].北京：中國輕工業出社，1998.141～142.

[3]黃秀梨，辛秀明.微生物學實驗指導.第二版[M].北京：高等教育出版社，2008.140～143.

[4]鞠華偉，江連洲，王秋京.高產堿性蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株選育及其水解條件的研究[J].食品工業科技，2007，28：109 ～ 111.

[5]計成，馬秋剛.新型蛋白質飼料開發與利用[M].北京：化學工業出版社，2006.92～94.

[6]劉超.可利用氨基酸飼料新技術[M].北京：中國農業出版社，2004.127～130.

[7]盧曉凌.大豆中抗營養因子脈酶和胰蛋白酶抑制劑不同測定方法的比較：[碩士學位論文][D].哈爾濱：東北林業大學，2008.

[8]牛春華，高巖，李玉秋.紫外誘變選育高產蛋白酶枯草芽孢桿菌[J].中國釀造，2011，12：67 ～ 69.

[9]游金明，李德發.大豆抗營養因子研究進展[J].新飼料，2006，9：40～43.

[10]周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1986.19～20.

[11]張克旭，陳寧.代謝控制發酵[M].北京：中國輕工業出版社，1998.63~65.

[12]Buchanan RE，Gibbons NE.伯杰細菌鑒定手冊.中國科學院微生物研究所伯杰細菌鑒定手冊翻譯組譯.第8版[M].北京：科學出版社，1984.729～730.

[13]Stale R，Stefan S，Erland B.Lactic acidfermentation eliminates indigestible carbohydrates and antinutritional factors in soybean meal for Atlantic salmon[J].Aquaculture，2005，246：331 ～ 345.