Empetrifranzinans A和Empetrifranzinans C的全合成及其抗腫瘤活性*

李人則，劉曉宇，焦曉臻，田承森，董 梁，謝 平

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室活性物質發現與適藥化研究北京市重點實驗室，北京 100050)

Empetrifranzinans A(1a)，Empetrifranzinans B和 Empetrifranzinans C(1b)是由 Sebastian 等［1］首次從植物Hypericum empetrifolium WILLD的地上部分分離得到的單萜檸檬烯類三環酰基間苯三酚類化合物。其中，1a和Empetrifranzinans B以兩種異構體的混合物形式存在，尚未分離到單一異構體。他們在體外對人微血管上皮細胞均表現出較好的抗增殖作用，其合成未見文獻報道，因此對其進行全合成研究，為對該類化合物進行進一步的藥理學活性評價具有重要意義。

本文以廉價易得的間苯三酚為起始原料，經Friedel-Crafts酰基化反應得取代間苯三酚(2a和2b)［2］;在20 mol%L-脯氨酸催化下，以 DMF 為溶劑，2a和2b分別與檸檬醛(3)于100℃反應10 h，分別以60%和55%的總收率首次合成了1a和1b(Scheme 1)，其結構經1H NMR，13C NMR和HR-MS確證。并采用MTT法對1a和1b進行了初步的體外抗腫瘤活性評價。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Yanaco MP-500D型顯微熔點儀(溫度未校正);PerkinElmer 241型旋光儀;Varian INOVA-500型和Mercury-400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標);Micromass Auto Spec Ultima-TOF型質譜儀。

薄層層析和常壓柱層析用硅膠，160目～200目，青島海洋化工廠;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)2的合成(以2a為例)

在反應瓶中加入硝基苯150 mL和無水間苯三酚20 g(158 mmol)，攪拌使其完全溶解;于室溫分三等份加入無水AlCl386.7 g(650 mmol)，反應30 min;滴加異丁酰氯 18.2 mL(174 mmol)，滴畢，于65℃反應8 h。倒入冰水中，用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并萃取液，用2 mol·L-1NaOH(2×150 mL)萃取，合并水相，用濃鹽酸中和至pH 4～5，乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有機層，用飽和NaCl洗滌，無水NaSO4干燥，減壓蒸除溶劑后經硅膠柱層析［洗脫劑:A=V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1～2∶1］純化得淡黃色固體 2a 26 g，收率 84%;1H NMR δ:12.26(s，2H)，10.31(s，1H)，5.81(s，2H)，3.88(m，1H)，1.07(d，6H，J=6.3 Hz)。

按類似方法合成淡黃色固體2b 6.4 g，收率82%;1H NMR δ:12.23(s，2H)，10.31(s，1H)，5.79(s，2H)，3.74(m，1H)，1.69(m，1H)，1.30(m，1H)，1.04(d，J=6.6 Hz，3H)，0.82(t，J=7.8 Hz，3H)。

(2)1的合成(以1a為例)

在反應瓶中加入2a 1.96 g(10 mmol)和無水DMF 20 mL，攪拌使其完全溶解;加入檸檬醛2.05 mL(12 mmol)和 L-脯氨酸 230 mg(2 mmol)，于100℃反應10 h。冷卻至室溫，加水30 mL，用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并有機相，用無水NaSO4干燥，蒸除溶劑后經硅膠柱層析［A=50 ∶1～20 ∶1］純化得淡黃色固體 1a 2.38 g，收率72%，m.p.138 ℃～139 ℃，［α］20D0°(c 0.7，MeOH);1H NMR δ:13.54(s，1H)，6.05(s，1H)，3.93(s，1H)，2.75(s，1H)，2.17(m，1H)，2.08(m，1H)，1.86(s，1H)，1.83(s，1H)，1.58(s，3H)，1.45(m，1H)，1.39(s，3H)，1.31(m，1H)，1.18(d，J=6.7 Hz，3H)，1.15(d，J=6.7 Hz，3H)，1.11(s，3H)，0.88(m，1H);13C NMR δ:209.6，164.9，162.2，159.0，107.4，106.4，97.1，86.4，75.9，46.2，38.1，37.5，34.9，29.9，28.7，27.6，24.4，21.8，20.1，18.5;HR-ESI-MS m/z:Calcd for C20H27O4{［M+H］+}331.190 4，found 331.190 5(表征數據與文獻［1］值吻合)。

按類似方法合成淡黃色固體1b 2.31 g，收率67%，m.p.117 ℃～118 ℃，［α］20D0°(c 0.5，MeOH);1H NMR δ:13.62(s，1H)，6.05(s，1H)，3.78(m，1H)，2.75(s，1H)，2.19(m，1H)，2.08(m，1H)，1.86(m，1H)，1.85(m，2H)，1.58(s，3H)，1.45(m，1H)，1.39(s，3H)，1.37(m，1H)，1.31(m，1H)，1.15(d，J=6.8 Hz，3H)，1.11(s，3H)，0.94(m，3H)，0.89(m，1H);13C NMR δ:209.3，165.0，162.3，159.1，107.5，106.9，97.1，86.6，75.9，46.3，45.1，37.5，34.9，29.9，28.7，27.6，25.9，24.4，21.8，17.6，12.2;HR-ESI-MS m/z:Calcd for C21H29O4{［M+H］+}345.206 0，found 345.206 8。

1.3 1的體外抗腫瘤活性測定

以人結腸癌細胞(HCT-8)、人肝癌細胞(Bel-7402)、人胃癌細胞(BGC-823)、人肺腺癌細胞(A549)和人卵巢癌細胞(A2780)為測試細胞株，采用MTT法對1a和1b進行了抗腫瘤活性實驗。將對數生長期的細胞用胰酶消化后，配制成一定濃度的單細胞懸液，按2 000個/孔接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，于37℃培養24 h。次日加入不同濃度藥物及相應溶劑對照的新鮮培養基，每孔加100 μL(DMSO 終濃度 ＜0.1%)，每種受試物設3個劑量組，每組設三個平行孔。于37℃培養120 h后棄上清，每孔加入200 μL新鮮配制的含0.5 mg·mL-1MTT的無血清培養基，培養4 h。棄上清，每孔加入200 μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，振蕩混勻后，酶標儀在570 nm處測定光密度值(OD)，以溶劑對照處理的腫瘤細胞為對照組，按下式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，并按中效方程計算IC50。

2 結果與討論

2.1 合成

1a和1b具有典型的單萜檸檬烯類多環酰基間苯三酚母核，雖然文獻［3］報道其可用取代間苯三酚與檸檬醛在吡啶存在下進行環合反應而得，但收率較低，且產物通常為兩種異構體的混合物，分離純化困難。近年來，韓國學者［4］報道了由乙二胺二乙酸(EDDA)催化的檸檬烯類化合物與間苯三酚的環合反應，避免了異構體的產生，但是由于催化劑EDDA價格較為昂貴，考慮到該反應的經濟適用性，我們希望篩選到一種更為廉價易得的催化劑，并達到EDDA的催化效果。從而使該合成方法具有更為廣泛的適用性。

以合成1a為模板，考察催化劑對本反應的催化活性，結果見表1。由表1可以看出，當催化劑用量為20 mol%時，使用L-脯氨酸收率達72%。同時發現，該反應適宜在較弱酸性條件下進行;隨著催化劑的酸性增強，1a收率隨之降低，二環副產物增多。從表1還可以看出L-脯氨酸作為催化劑，具有廉價易得、收率高等優點，是該反應的理想催化劑。此外，值得一提的是，經1H NMR和NOESY分析表明，在1a中可觀察到2'-H與8″，9″-H的相互作用，而非2'-H與10″-H的相互作用，說明1a為單一構型，沒有異構體的產生。同樣，在1b中也只觀察到2'-H與8″，9″-H的相互作用(Chart 1)。

表1 催化劑對環合反應的影響*Table 1 Effect of catalyst on cyclization

Chart 1

以L-脯氨酸為催化劑，考察溫度(室溫、100℃)和溶劑(二氯甲烷、四氫呋喃、甲醇、甲苯或DMF)對反應的影響。實驗結果表明，于室溫反應10 h，均未得到1a;于100℃反應10 h，以二氯甲烷、四氫呋喃、甲醇為溶劑，也未發生預期反應;而以甲苯為溶劑時收率達65%;DMF為溶劑時，收率達72%。由此看出，除去溶劑對反應的影響，溫度似乎起到了更大的作用。

2.2 抗腫瘤活性

為了研究1潛在的抗腫瘤活性，對其進行了抗腫瘤活性測試，結果見表2。由表2可見，1a對測試細胞株HCT-8，Bel-7402，BGC-823，A549和A2780表現出了較強的細胞毒作用。

表2 1的體外抗腫瘤活性*Table 2 Antitumor activities of 1

本研究結果為進一步考察該類天然產物的構效關系奠定了基礎。

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