血清總補(bǔ)體活性測(cè)定的安全模擬方法

王美惠，吳素琴

（遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101）

補(bǔ)體是一組經(jīng)活化后具有酶活性的球蛋白，廣泛參與免疫防御與免疫調(diào)節(jié)功能，因此，血清補(bǔ)體是反映機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一。正常人血清中的補(bǔ)體活性及含量相對(duì)穩(wěn)定，但在某些病理情況下，血清補(bǔ)體水平可發(fā)生變化。因此，臨床上動(dòng)態(tài)觀察血清總補(bǔ)體溶血活性，對(duì)一些疾病有輔助診斷的意義[1]。學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室做血清補(bǔ)體活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)要用人血清，即使是健康人血清也不是十分安全，也可能有其他病毒。為了讓學(xué)生安全地上好實(shí)驗(yàn)課，筆者采用了模擬方法，效果滿意，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)原理

綿羊紅細(xì)胞（SRBC）與相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合形成的致敏紅細(xì)胞可通過經(jīng)典活化途經(jīng)激活補(bǔ)體，從而導(dǎo)致SRBC溶解。當(dāng)紅細(xì)胞與溶血素的濃度恒定時(shí)，在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，補(bǔ)體的量及其活性與溶血程度呈正相關(guān)。由于溶血程度在50%左右（30%～70%）時(shí)，補(bǔ)體的用量稍有變化就會(huì)對(duì)溶血程度產(chǎn)生很大的影響，所以通常以50%溶血程度（CH50）作為判定反應(yīng)終點(diǎn)的指標(biāo)，而不是用100%溶血程度[2]。

2 試劑與器材

（1）巴比妥緩沖液（PH7.4）。

（2）2%SRBC懸液。取新鮮脫纖維或Alsever液保存綿羊血，加數(shù)倍量的生理鹽水混勻，2000r/min離心10分鐘，棄上清液。如此洗滌3次后，取管底壓積紅細(xì)胞，用巴比妥緩沖液配成2%細(xì)胞懸液。為了使懸液濃度標(biāo)準(zhǔn)化，可取2%SRBC懸液0.2ml加巴比妥緩沖液4.8ml稀釋25倍，用0.5cm比色杯于721分光光度計(jì)542nm波長(zhǎng)處比色。調(diào)整透光率，要求達(dá)到40%。若有偏差，應(yīng)進(jìn)行校正。

（3）溶血素（抗SRBC抗體）。按效價(jià)用巴比妥緩沖液稀釋至2個(gè)單位。如效價(jià)為1∶4000，使用時(shí)稀釋至1∶2000。

（4）待檢血清（模擬實(shí)驗(yàn)用豚鼠血清代替人血清）、生理鹽水、蒸餾水。

（5）離心機(jī)、試管、刻度吸管、恒溫水浴箱、721分光光度計(jì)、比色杯等。

3 模擬方法

3.1 豚鼠血清制備

（1）準(zhǔn)備幾只健康的豚鼠。

（2）用無菌注射器分別對(duì)幾只豚鼠進(jìn)行心臟采血，將血液分別放入無菌試管內(nèi)，置4℃冰箱內(nèi)過夜。

（3）用無菌吸管將豚鼠血清吸出后全部放在一個(gè)無菌的錐形瓶?jī)?nèi)混勻。

（4）分裝：用無菌刻度吸管每次吸取1ml豚鼠血清放入一個(gè)無菌的小離心管內(nèi)，然后把離心管的蓋蓋好。

（5）將這些小離心管貼好標(biāo)簽后放入紗布袋，放于液氮罐中長(zhǎng)期保存；或?qū)⑿‰x心管放在小飯盒內(nèi)，放入-60℃冰箱內(nèi)，可至少保存兩年。

3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

（1）實(shí)驗(yàn)前取出一支豚鼠血清于室溫融化，然后將豚鼠血清用巴比妥緩沖液稀釋成 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50等濃度。

（2）以 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50等濃度的豚鼠血清代替 1∶20的人血清，按照表1所示加入各試劑分別做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

表1 血清總補(bǔ)體溶血活性測(cè)定

（3）將每組預(yù)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)管以2500r/min離心5分鐘后觀察結(jié)果。用目測(cè)法觀察各組反應(yīng)管，并與50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管比較，找出溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管最接近的反應(yīng)管（最好在4～7號(hào)管之間），并用該反應(yīng)管所在預(yù)實(shí)驗(yàn)組的豚鼠血清的稀釋濃度代替1∶20的人血清。如果有幾組預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都符合標(biāo)準(zhǔn)，就選擇最大稀釋濃度的豚鼠血清代替1∶20的人血清。

（4）記錄預(yù)實(shí)驗(yàn)最佳豚鼠血清濃度，每次實(shí)驗(yàn)前取出幾支豚鼠血清用巴比妥緩沖液稀釋成最佳濃度即可，不必重復(fù)做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

4 操作方法

（1）制備50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管：取2%SRBC懸液2ml加蒸餾水8ml，SRBC全部溶解，為100%全溶管。取全溶管上清液2.5ml加巴比妥緩沖液2.5ml，混勻，即為50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管。

（2）稀釋待檢血清：吸取新鮮待檢血清0.2ml，加入巴比妥緩沖液 3.8ml，將血清進(jìn)行1∶20稀釋。

（3）取試管10支，按順序編號(hào)，然后按照表1所示加入各試劑，將各管混勻，置37℃水浴30分鐘后測(cè)定補(bǔ)體活性。

5 結(jié)果判斷

將各反應(yīng)管以2500r/min離心5分鐘后，先用目測(cè)法觀察各管，并與50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管比較，選擇溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管最接近的兩管，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)542n m處進(jìn)行比色。以緩沖液作為空白，校正零點(diǎn)，找出透光率與標(biāo)準(zhǔn)管最接近的一管，根據(jù)該管的血清用量，求出總補(bǔ)體溶血活性。

血清總補(bǔ)體活性 CH50（U/ml）=1/血清用量（ml）×血清稀釋倍數(shù)。

以本法測(cè)定的血清總補(bǔ)體溶血活性，CH 50正常參考值范圍為 50～100U/ml[1]。

學(xué)生采用該方法進(jìn)行血清總補(bǔ)體活性測(cè)定時(shí)非常安全，實(shí)驗(yàn)效果也較好。

[1]陳敏.臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[2]劉輝.臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.