血清總補體活性測定的安全模擬方法

王美惠，吳素琴

（遼寧衛生職業技術學院，遼寧 沈陽 110101）

補體是一組經活化后具有酶活性的球蛋白，廣泛參與免疫防御與免疫調節功能，因此，血清補體是反映機體非特異性免疫功能的重要指標之一。正常人血清中的補體活性及含量相對穩定，但在某些病理情況下，血清補體水平可發生變化。因此，臨床上動態觀察血清總補體溶血活性，對一些疾病有輔助診斷的意義[1]。學生在實驗室做血清補體活性測定實驗時要用人血清，即使是健康人血清也不是十分安全，也可能有其他病毒。為了讓學生安全地上好實驗課，筆者采用了模擬方法，效果滿意，現報告如下。

1 實驗原理

綿羊紅細胞（SRBC）與相應抗體（溶血素）結合形成的致敏紅細胞可通過經典活化途經激活補體，從而導致SRBC溶解。當紅細胞與溶血素的濃度恒定時，在規定的反應時間內，補體的量及其活性與溶血程度呈正相關。由于溶血程度在50%左右（30%～70%）時，補體的用量稍有變化就會對溶血程度產生很大的影響，所以通常以50%溶血程度（CH50）作為判定反應終點的指標，而不是用100%溶血程度[2]。

2 試劑與器材

（1）巴比妥緩沖液（PH7.4）。

（2）2%SRBC懸液。取新鮮脫纖維或Alsever液保存綿羊血，加數倍量的生理鹽水混勻，2000r/min離心10分鐘，棄上清液。如此洗滌3次后，取管底壓積紅細胞，用巴比妥緩沖液配成2%細胞懸液。為了使懸液濃度標準化，可取2%SRBC懸液0.2ml加巴比妥緩沖液4.8ml稀釋25倍，用0.5cm比色杯于721分光光度計542nm波長處比色。調整透光率，要求達到40%。若有偏差，應進行校正。

（3）溶血素（抗SRBC抗體）。按效價用巴比妥緩沖液稀釋至2個單位。如效價為1∶4000，使用時稀釋至1∶2000。

（4）待檢血清（模擬實驗用豚鼠血清代替人血清）、生理鹽水、蒸餾水。

（5）離心機、試管、刻度吸管、恒溫水浴箱、721分光光度計、比色杯等。

3 模擬方法

3.1 豚鼠血清制備

（1）準備幾只健康的豚鼠。

（2）用無菌注射器分別對幾只豚鼠進行心臟采血，將血液分別放入無菌試管內，置4℃冰箱內過夜。

（3）用無菌吸管將豚鼠血清吸出后全部放在一個無菌的錐形瓶內混勻。

（4）分裝：用無菌刻度吸管每次吸取1ml豚鼠血清放入一個無菌的小離心管內，然后把離心管的蓋蓋好。

（5）將這些小離心管貼好標簽后放入紗布袋，放于液氮罐中長期保存；或將小離心管放在小飯盒內，放入-60℃冰箱內，可至少保存兩年。

3.2 預實驗

（1）實驗前取出一支豚鼠血清于室溫融化，然后將豚鼠血清用巴比妥緩沖液稀釋成 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50等濃度。

（2）以 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50等濃度的豚鼠血清代替 1∶20的人血清，按照表1所示加入各試劑分別做預實驗。

表1 血清總補體溶血活性測定

（3）將每組預實驗的反應管以2500r/min離心5分鐘后觀察結果。用目測法觀察各組反應管，并與50%溶血標準管比較，找出溶血程度與標準管最接近的反應管（最好在4～7號管之間），并用該反應管所在預實驗組的豚鼠血清的稀釋濃度代替1∶20的人血清。如果有幾組預實驗的結果都符合標準，就選擇最大稀釋濃度的豚鼠血清代替1∶20的人血清。

（4）記錄預實驗最佳豚鼠血清濃度，每次實驗前取出幾支豚鼠血清用巴比妥緩沖液稀釋成最佳濃度即可，不必重復做預實驗。

4 操作方法

（1）制備50%溶血標準管：取2%SRBC懸液2ml加蒸餾水8ml，SRBC全部溶解，為100%全溶管。取全溶管上清液2.5ml加巴比妥緩沖液2.5ml，混勻，即為50%溶血標準管。

（2）稀釋待檢血清：吸取新鮮待檢血清0.2ml，加入巴比妥緩沖液 3.8ml，將血清進行1∶20稀釋。

（3）取試管10支，按順序編號，然后按照表1所示加入各試劑，將各管混勻，置37℃水浴30分鐘后測定補體活性。

5 結果判斷

將各反應管以2500r/min離心5分鐘后，先用目測法觀察各管，并與50%溶血標準管比較，選擇溶血程度與標準管最接近的兩管，用分光光度計于波長542n m處進行比色。以緩沖液作為空白，校正零點，找出透光率與標準管最接近的一管，根據該管的血清用量，求出總補體溶血活性。

血清總補體活性 CH50（U/ml）=1/血清用量（ml）×血清稀釋倍數。

以本法測定的血清總補體溶血活性，CH 50正常參考值范圍為 50～100U/ml[1]。

學生采用該方法進行血清總補體活性測定時非常安全，實驗效果也較好。

[1]陳敏.臨床免疫學檢驗實驗指導[M].4版.北京：人民衛生出版社，2011.

[2]劉輝.臨床免疫學與檢驗實驗指導[M].3版.北京：人民衛生出版社，2009.