重組exendin-4類似物EW的制備及其體內降糖活性分析

吳曉琰 施小梅 陸怡

(復旦大學附屬華山醫院老年科，上海 200040)

理想的抗糖尿病藥物應能長期控制血糖，維持胰腺β細胞體積并防止其功能減退，保護正常的進食生理反應。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是小腸黏膜分泌的多肽，進食后濃度迅速增高，半衰期 1.5 ～2.1 min［1］。GLP-1 對 2 型糖尿病的多重作用包括血糖依賴性刺激胰島素分泌、增加胰腺β細胞體積及功能、抑制胰高血糖素分泌及食欲。GLP-1由血漿中的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)酶解，由腎臟及其他蛋白酶如人中性內肽酶24.11(neutral endopeptidase 24.11，NEP24.11)清除，前者為主要途徑。GLP-1受體途徑治療是目前糖尿病治療的新的里程碑［2-3］，包括GLP-1受體激動劑及DPP4酶抑制劑。GLP-1受體激動劑exendin-4含39個氨基酸，與GLP-1受體結合并激活受體，模擬GLP-1的功能。exendin-4肽鏈:HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEW LKNGG PSSGA PPPS(NH2)，其N端的序列為His、Gly，能夠抵抗DPP4，半衰期3～5 h，化學合成的exendin-4于2005年被 FDA批準。研究［4-5］證明 exendin-4具有良好的降糖作用，且安全性高，可以單獨應用或與其他口服抗糖尿病藥物聯用。exendin-4還可使患者體質量持續減輕，并使多項心血管危險因素如胰島β細胞功能穩態模型評估(homeostasis model assessment for beta cell function，HOMA-B)、血壓、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)下降，使保護因素高密度脂蛋白(HDL)升高，并且使基線時升高的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)恢復正常，不良反應少，耐受良好［6］。然而exendin-4較 GLP-1多9個氨基酸，有免疫源性，40% ～50%患者血漿中檢測到不同滴度的抗體［7］。

根據既往研究，本研究設計了exendin-4類似物EW(PCT/CN2009/001321，exendin-4 的類似物)，肽鏈長度32個氨基酸。其C末端為OH，長度及氨基酸組成與母體GLP-1相近，N端的3個氨基酸為His、Gly、Glu。與 exendin-4 相同，EW 能抵抗 DPP4的酶解，在體內具有與exendin-4相似的降糖活性，其結構適合基因工程制備。EW肽鏈:HGEGT YTSDL SSQME EEAVK LFIEW LLNGG PR(OH)。

1 資料與方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠(購自上海中國科學院實驗動物中心)，大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)JM109 DH5α，質粒 pUC18，限制性內切酶(EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ及 SalⅠ)，T4 DNA 連接酶，Taq 酶，高保真酶PrimerSTARTM HS DNA Polymerase等(美國Invitrogen公司生產)。exendin-4(美國Lilly公司生產)。測試及制備 HPLC(美國 Agilent公司生產)。飛行質譜MALDI-MS(LCQ Deka XP Plus，美國Thermo公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因工程菌 E.coli保存方法 0.4 mL的100%甘油中加入0.6 mL的log中期的非誘導菌長至飽和的培養基中，充分攪勻，置于-70℃冰箱中保存。

1.2.2 構建EW基因 EW的多肽序列如上，EW基因C-末端設計為E.coli的終止密碼;寡核苷酸設計中含EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ位點和氨基端的一個胰蛋白酶酶切位點Arg。采用以下5個引物，在PCR儀上進行擴增:引物1(5’-AATTCCAGATCTCGTCACGGCGAAGGCACCTACA-3’);引物 2(5’-CTGGCTGCTCAGATCGCTGGTGTAGGTGCCTTCG-CCGTGACGAGATCTGG-3’);引物 3( 5 ’-CCAGCGATCTGGCAGCCAGATGGAAGAAGAAGC-GGTTAA-3’);引 物 4(5’-CCAGCCATCAGAACAGTTTAACCGCTTCTTCTTCCAT-3’);引 物 5(5’-ACTGTTCATCGATGGTGTTAACGGCGGCCCGCGTGGATCCT-AG-3’)。

1.2.3 構建含8個拷貝EW的基因序列及感受態E.coli表達菌株 將pUC18質粒和合成的DNA用EcoRⅠ及SalⅠ酶切，連接并轉入E.Coli DH5α中。陽性重組質粒用PCR的方法驗證。證實的重組質粒用BamHⅠ及SalⅠ進行酶切;同時，合成的DNA用BglⅡ及SalⅠ進行酶切;連接并轉入pUC18質粒中。從而得到具有2個拷貝的EW基因的陽性重組質粒。不斷重復，直至重組pUC18質粒中包含8個拷貝EW的基因序列。將pUC18+8EW陽性質粒轉入E.Coli JM 109菌種，經鑒定為陽性克隆者，作為菌種保存。

1.2.4 細菌發酵 在LB培養基(pH 7.0)300 mL中加入轉化體基因工程菌200 μL、25 mg/mL的氨芐西林700 μL、1 mL的50%的甘油以及20%硫酸鎂300 μL，恒溫振蕩器中 200 r/min(37 ℃)，使基因工程菌 E.coli生長，當細菌生長至 OD600=0.9時加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導8 h，取出錐形瓶，4℃ 5000 r/min離心45 min，除去上清液，收集E.coli菌體沉淀。-70℃冰箱保存。

1.2.5 融合蛋白電泳 采用分離膠濃度為12%的SDS-PAGE進行蛋白電泳。發酵液未加IPTG誘導、發酵液加IPTG誘導后8 h以及發酵液加IPTG誘導后12 h，各取1 mL發酵液置于塑料EP離心管中，8000 r/min離心5 min，除去上清液，溶解樣品，細菌裂解物加入1 mL SDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸3 min，加入少量尿素晶體增溶，加樣20 μL，進行蛋白電泳。按分子量標志物、未誘導、誘導8 h、誘導12 h的順序加樣，電泳。

1.2.6 純化融合蛋白 沉淀懸浮于8 mol/L尿素溶液，用勻漿器15000 r/min打勻。溶液4℃15000 r/min離心30 min，上清中含可溶性包涵體。然后將上清液按1∶25稀釋，逐滴加入復性緩沖液［1 mol/L Tris-HCl(pH 7.3)，0.25 mol/L 蔗糖，2 mmol/L EDTA］，持續攪拌，20℃保存24 h。再經過15000 r/min(4℃)離心30 min后取沉淀。加入2 mol/L尿素溶液，洗滌，10000 r/min離心30 min后取沉淀，重復3次。將沉淀真空冷凍干燥。

1.2.7 融合蛋白的酶切及制備 將300 mg包涵體加入雙蒸餾水200 mL，電磁攪拌，逐滴加入二羧酸，用碳酸氫鈉調節pH值保持7.0，將融合蛋白溶于水，透析，pH 7.5，加入高純度的胰蛋白酶5 mg及5 μL 20%氯化鈣溶液，2 mol/L鹽酸溶液1 mL。30℃ 5 h，持續電磁攪拌。逐滴加入2 mol/L鹽酸溶液，至pH值3，室溫過夜，4℃ 10000 r/min離心30 min，取沉淀。制備反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)1100 series(美國 Agilent公司)，C18柱(φ30×300 mm)。線性梯度20% ～80%乙腈，含0.1%三氟乙酸，30 mL/min，30 min一個周期。220 nm的每個峰均進行小肽蛋白電泳分析。將沉淀溶于水，每次進樣量為5 mL。制備HPLC顯示，24.4 min峰為目標峰。收集目標峰。真空負壓冷凍干燥，-70℃儲存。

1.2.8 C57BL/6小鼠的降糖作用 實驗遵循“北京醫科大學動物照料及福利委員會”準則。C57BL/6小鼠(雄性，8周，體質量約20 g)飼養在恒溫［(22±2)℃］、12 h照明/12 h黑暗的環境中。飲水及標準嚙齒類動物飲食供應。18 h禁食后，毛細管取10 μL尾靜脈血，轉入肝素化微量離心管中，離心后將血漿保存于-20℃、待血糖測定。血漿葡萄糖測定采用葡萄糖氧化酶法。隨機分為3組，每組10只，組間體質量差異無統計學意義(P＞0.05)，3組小鼠取空腹血后分別腹腔注射 EW(2 μg EW/100 μL 0.9%氯化鈉溶液)、exendin-4(2 μg exendin-4/100 μL 0.9%氯化鈉溶液)、0.9%氯化鈉溶液(100 μL)之后，即刻及每隔2 h腹腔內注射20%葡萄糖300 μL，腹腔內注射葡萄糖共4次直至最初給糖后8 h。每次給葡萄糖后20 min取10 μL尾靜脈血，測定血糖。

1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以均值±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 構建含8個拷貝EW的基因序列 pUC18質粒和合成的 DNA 用 EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ及 SalⅠ酶切，全序列見圖1，8個基因串聯的方法見圖2。

圖1 8個拷貝的EW基因的全序列

2.2 表達含8個拷貝EW基因的融合蛋白 少量轉染E.coli，檢測質粒能否有效表達。加樣量20 μL，采用分離膠12%的SDS-PAGE進行蛋白電泳。見圖3。轉化后的E.coli中EW的表達量可達20%。

2.3 發酵 恒溫振蕩器中于200 r/min 37℃發酵，4℃ 5000 r/min離心45 min后除去上清液，收集沉淀為基因工程菌菌體。錐形搖瓶培養最終收率是200～250 mg濕細胞/L發酵液。

2.4 純化融合蛋白、融合蛋白的酶切及制備HPLC顯示，24.4 min峰為目標峰。目標峰真空負壓冷凍干燥。目的多肽EW的制備HPLC圖形見圖4，1為目的峰。

2.5 EW的飛行質譜分析 冷凍干燥后白色粉末溶于雙蒸水1 mg/mL，進樣量10 μL，行MALDI-MS。目的多肽EW分子量為3581.5 Da。

2.6 血漿葡萄糖測定 注射前EW、exendin-4及對照組平均血糖分別為(6.39 ±1.37)mmol/L、(5.87±1.16)mmol/L 及(6.18 ± 1.15)mmol/L(P ＞ 0.05)。4次葡萄糖注射后，對照組平均血糖逐漸上升至(25.04 ±2.10)mmol/L，而 EW 及 exendin-4 治療組平均血糖濃度分別是(8.54 ±2.10)mmol/L、(6.93±1.84)mmol/L，兩組間差異無統計學意義，但治療組與對照組間差異有統計學意義(P＜0.01)。

3 討 論

化學合成的exendin-4價格高昂。我國華東理工大學在畢赤酵母中以融合蛋白的形式表達exendin-4，發酵需要120 h，融合蛋白以腸激酶切斷純化，目的 exendin-4收率低，約3.15 mg/10 g細菌。此外，腸激酶是昂貴的蛋白水解酶，不適合工業用［8］。我們的研究發現，32個氨基酸的類似物具有與exendin-4相同的生物活性(另文發表)。因此本研究將exendin-4縮短至32個氨基酸并更換部分氨基酸，設計了exendin-4類似物EW，將EW串聯后在E.coli中表達，通過胰蛋白酶定點切斷獲得重組EW。胰蛋白酶切斷肽鏈的位點在賴氨酸或精氨酸的羧基端。EW的序列中有1個賴氨酸及1個精氨酸。我們應用二羧酸可逆性與賴氨酸結合保護了賴氨酸的胰蛋白酶的酶切位點，在后續的酶切反應中，胰蛋白酶僅切斷串聯表達的融合蛋白EW8，酶切位點是每個精氨酸的羧基端。酶切后，調整pH值以除去二羧酸，從而獲得8個重組EW。EW收率為70～80 mg/10 g細菌。這種胰蛋白酶酶切可以用于末端是精氨酸的肽鏈，但肽鏈中不含精氨酸的目的多肽，不論肽鏈中有無賴氨酸。精氨酸可以作為一種標簽用于串聯表達目的多肽。胰蛋白酶在二羧酸對賴氨酸保護后精氨酸羧基端的切斷將會成為基因工程多肽合成時一種新的蛋白酶切的方法，這在既往多肽基因工程合成中從未被報告過。

重組EW在小鼠體內顯示了良好的降糖活性。在我們的降糖作用評估中，僅1次給 EW及exendin-4，每隔2 h給予糖負荷，降糖作用保持6 h以上。這表明exendin-4的C-端的7個氨基酸對于exendin-4體內的生物活性并非必須。

初步研究發現，EW這一exendin-4類似物是一個很有希望的抗糖尿病藥物，它能通過基因工程大規模生產，值得進一步研究。

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