熒光法海水葉綠素a 傳感器設計

張可可，閆星魁，陳世哲，劉世萱，齊勇

(山東省海洋環境監測技術重點實驗室，山東省科學院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001)

工農業的快速發展使海洋污染日趨嚴重，對海水中浮游植物現存量進行實時、有效的監測成為海水污染監測和治理的關鍵［1］。葉綠素a 是海洋生態系統的一個重要參數，原位葉綠素a 分析已經成為海洋生態系統監測的重要手段之一［2］。傳統的葉綠素a 濃度測量大都是在實驗室條件下進行，而現場、長期的自動觀測，對于海洋水質監測具有非常重要的意義。現在的便攜式原位檢測儀器，基本都是從國外進口，價格昂貴。設計實用的海水葉綠素原位監測設備，對于我國進行海洋水質監測、赤潮的提前預報等具有極其重要的意義。本文設計的熒光葉綠素a 傳感器基于熒光誘導檢測原理結合微弱信號檢測技術，實現對海水葉綠素a濃度的原位監測。設備應用微弱光電感應、濾波和鎖相放大濾波等微弱信號檢測技術將信號從周圍的噪聲中提取出來，檢測探頭的機械結構采用15°夾角的背光接收模式，具有小型化、易于操作的特點。

1 葉綠素a 檢測原理

熒光分析法作為應用熒光技術的一種分析方法，已經成為微量物質分析中應用最為廣泛的方法之一。熒光產生的過程實際上是分子受激發而產生的能量輻射過程，一個分子中處于基態能級的電子吸收了滿足一定頻率條件的光子后，躍遷到更高的能級而處于激發態，由于激發態的分子是不穩定的，在極短的時間內，它們首先因分子間相互碰撞而以熱的形式損失掉一部分能量，從所處激發態下降至第一電子激發態的最低振動能級，然后再由這一能級下降至基態的任何振動能級。在后一過程中，激發態分子以光的形式釋放出所吸收的能量，發出的光稱為熒光［3-4］。

利用激發光誘導熒光對自然水體的水質監測是一種快速、實時和在線的檢測方法［5］，波長在460 nm 附近的藍光和685 nm 附近的紅光均可誘導出熒光，由于685 nm 附近的紅光誘導出的熒光波長與激發紅光波長相近［6-7］，為了能夠有效的區分出熒光和激發光，本文采用460 nm 的藍光作為激發光源。

根據比爾-朗伯定律，當葉綠素a 經波長為460 nm 附近的光激發后，會誘導出680 nm 附近的熒光［8］，所發射的熒光強度為:

式中k 為儀器常數;Q 為物質熒光效率;I0為激勵光光強;ε 為摩爾吸收系數;b 為樣品光程差;c 為葉綠素a 的濃度。

展開(1)式中的指數項，可得:

海水中葉綠素a 的濃度較低，2.3εbc ?1，(2)式可簡化為:

根據式(3)可知，激發的熒光強度與葉綠素a 的濃度成正比，檢測接收到的熒光光強，經過后續數據處理可以得到樣品中葉綠素a 的濃度。

熒光強度是由多個因素共同確定的，除了與葉綠素a 的濃度、吸光系數、熒光效率等參數有關外，還與激勵光光強、樣品光程差、光電轉換系數、電路放大倍數等因素有關。因此，設備檢測到的熒光強度是一個相對強度，需要在固定的光學環境下，采用標準濃度的葉綠素萃取液進行標定實驗，然后根據實驗數據擬合得到的工作曲線，通過測量海水樣品所激發的熒光值，經過數據處理得到海水中的葉綠素a 的濃度。

2 系統設計

在葉綠素a 濃度較低的情況下，激發出的熒光非常微弱，經過光電轉化后，其大小在nA 量級，這種量級的信號通常淹沒在周圍的噪聲中，設備采用微弱光電感應技術、濾波技術和鎖相放大濾波技術等微弱信號檢測技術將信號從周圍的噪聲中提取出來，葉綠素a測量系統框圖如圖1 所示。

圖1 葉綠素a 測量系統框圖Fig.1 System block diagram of a chlorophyll-a measurement system

在光學設計上，關鍵技術首先在于濾光片的處理，用來消除雜散光產生的干擾信號。在低濃度的微光測量中，為提高測量靈敏度，要求濾光片截止很深，以避免極微弱的光泄露［9］。葉綠素a 激發光采用460 nm 藍光LED，濾光片采用北京大恒光電的窄帶干涉濾光片，在發射端采用中心波長為470 nm 的窄帶濾光片，半寬為30 nm，截止深度為OD6;接收端采用650 nm的高通濾光片，截止深度為OD6。檢測探頭的機械結構模仿亞力克結構，采用15°夾角的背光接收模式，方便以后加裝清潔用的刷子。

發射模塊電路通過TLC555 方波發生電路產生頻率為2f 的方波信號，經過信號調理電路后，輸出占空比嚴格為50%的頻率為f 的方波，再將此信號分為兩路，一路用來驅動中心波長為460 nm 的藍光LED，另一路經過延時電路送入鎖相放大電路作為同步信號。

接收模塊通過高通濾光片和光電感應電路完成光電轉換，光電感應電路采用Silicon Sensors 光電二極管PC10-2-TO5 實現。信號處理模塊將光電轉換得到的光信號經前置的隔直、放大電路，輸出微弱的電信號，再經過次級濾波、放大電路進行信號放大，設計中使用高精度低噪聲放大器AD8641 作為前置放大和次級濾波主器件，然后利用AD8642 和OPA2277 完成信號放大-帶通濾波-放大電路，得到初步處理過的信號。鎖相濾波電路以輸入同步信號為基準，將上級的輸入正弦波信號進行鎖相濾波處理后輸出直流電平，得到平穩的直流信號。采用C8051F021 單片機進行數據采集，經過AD 轉換將采樣的數據送至外部SRAM 存儲，并配合數字濾波技術對數據進行優化，去除由于系統不穩定等因素可能會出現的異常數據，通過數據處理得到海水葉綠素a 的濃度。

3 結果分析

葉綠素a 定標采用實驗室方法配置葉綠素a 的標準溶液，并使用蒸餾水稀釋配置濃度分別為0.1、1、10、20、30、40、50 μg/L 的7 種濃度的標準葉綠素a 樣品稀釋溶液，用檢測設備樣機對各個濃度的樣品進行檢測，得出系統測量值與標準葉綠素a 濃度的對應關系。表1 給出了采樣不同濃度葉綠素a 得到的5 組原始實驗數據。

表1 不同濃度葉綠素a 原始實驗數據Table 1 Original experimental data of different concentrations of chlorophyll-a

為了減小系統隨機噪聲引入的誤差，對多次采樣得到的檢測輸出信號進行累加平均。根據表1 中的實驗數據，利用最小二乘法對實際測量葉綠素a 濃度得到的輸出信號與標準濃度值進行線性擬合，其擬合方程為:

式中:y 為檢測輸出信號幅值;x 為葉綠素a 標準濃度值。圖2 為標準濃度的葉綠素a 溶液與輸出信號的對應關系，其線性擬合系數為0.999，可見在該測量濃度范圍內，葉綠素a 濃度與檢測信號幅值呈現很好的線性關系。

在實驗過程中發現，葉綠素a 在低濃度時，受環境影響較大，需要固定的光學環境進行測量和定標。同時，為了得到更高的檢測靈敏度和檢測精度，檢測設備需進一步抑制電磁干擾噪聲，并優化檢測設備的機械結構。

4 結論

本文在研究熒光法葉綠素a 檢測原理的基礎上，應用熒光誘導技術和微弱信號檢測技術設計了熒光葉綠素α傳感器，實驗結果表明，系統設計具有可行性，可解決海水葉綠素a 濃度的高精度、長期連續自動監測關鍵技術難題。檢測過程不需人工采樣和預處理，具有檢測靈敏度高、體積小、易于操作的特點，能夠廣泛應用于海洋浮標、潛標、臺站、監測船等不同監測平臺，對我國海洋水質監測、赤潮的提前預報等具有極其重要的意義。

圖2 葉綠素a 濃度與輸出信號實驗曲線Fig.2 Experimental curve of the output signals and the concentrations of chlorophyll-a

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