超高壓輔助濁點萃取法提取富集蓮子心總生物堿

朱榮華 ，王曉 ，劉建華 ，張樹芹，劉峰

(1.山東農業大學化學與材料科學學院，山東 泰安 271018;2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

植物中活性成分的提取、富集是分離與分析的第一步，也是最關鍵的一步。近年來一些新技術，如超臨界流體萃取［1］、微波輔助提?。?-3］等已被廣泛應用于中藥活性成分的提取過程中，但是這些方法存在耗時長，能耗高等缺點。超高壓提取(ultrahigh pressure extraction，UPE)是利用100 MPa 以上的流體靜壓力作用于溶劑和中藥的混合液，保壓一段時間(幾分鐘)后卸壓，從而達到提取的目的［4-5］，已廣泛應用于中藥有效成分的提取，如葡萄皮中提取花青素［6］、茶葉中提取茶多酚［7］、荔枝果皮中提取黃酮類化合物［8］和人參中提取人參皂苷［9］等。該方法與傳統技術相比，可以大大縮短提取時間、降低能耗、減少雜質成分的溶出，提高有效成分的收率，避免了因熱效應引起的有效成分結構變化、損失以及生理活性的降低［10-11］。濁點萃取(cloud point extraction，CPE)是以表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點現象為基礎，通過改變一定的萃取條件(如電解質、溫度、時間等)，達到將水溶性物質與親油性物質分離的目的［12］。該方法完全取代了有機溶劑，具有經濟、高效的特點［13］，有著廣闊的應用前景。因此，超高壓提取與濁點萃取技術相結合，可在無有機溶劑條件下實現快速提取、富集天然產物中的有效成分。目前，超高壓-濁點萃取技術提取、富集天然產物有效成分的研究尚未見文獻報道。

蓮子心是蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)成熟種子中的綠色胚芽，主要成分為生物堿，包括甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿等［14］?，F代醫學研究表明，蓮子心具有抗多種實驗性心律失常、抗血小板聚集及降壓等作用［15］。

本文對超高壓-濁點萃取蓮子心中生物堿的影響因素進行了系統研究。通過表面活性劑類型、濃度、提取壓力、時間、料液比等單因素實驗確定了液-固提取工藝條件;進一步通過NaCl 濃度、平衡溫度、平衡時間等單因素實驗確定了濁點萃取富集條件。結果表明，此方法可在極短的時間內實現蓮子心生物堿的提取、富集。

1 儀器和試劑

1.1 儀器與設備

HPP.L3-600 型超高壓生物提取設備(天津市華泰森淼生物工程技術有限公司);UV-2550 型雙光束紫外-可見分光光度計(日本島津公司);AE240 分析天平(METTLER 公司)。

1.2 原料與試劑

蓮子心購自山東中醫藥大學中魯藥店，甲基蓮心堿對照品購自天然產物國家標準樣品參比實驗室;烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)均購自天津市科密歐化學試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、氯化鈉為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、無水乙醇為分析純，均購自濟南巨業化學試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 超高壓提取方法

稱取一定量的樣品，轉入聚乙烯塑料袋中，按照一定的料液比加入溶劑，密封。在一定壓力下，提取一定時間，卸壓后，過濾，得提取液，分析總生物堿含量。所有實驗均重復3 次，取平均值。

2.2 濁點萃取方法

將上述過濾后的提取液中加入一定量的NaCl，混勻，放入設定溫度的恒溫水浴中加熱。平衡一段時間后，進行離心分離，使表面活性劑相與水相分離。分別量取兩相體積并測定兩相中蓮子心生物堿的含量。所有實驗均重復3 次，取平均值。

2.3 總生物堿含量測定

精確配制0.50 mg/mL 的甲基蓮心堿對照品溶液，用甲醇分別稀釋2、5、10、20、50 倍后，用紫外-可見分光光度計于280 nm 下分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標，甲基蓮心堿濃度(mg/mL)為橫坐標作圖，得線性回歸方程:Y=-0.04826+12.52484X，R2=0.9992。

分別取提取液、表面活性劑相、水相溶液100 μL 用去離子水稀釋定容至10 mL，測定總生物堿含量，計算提取率及萃取回收率。

2.4 萃取回收率及濃縮系數

萃取回收率=表面活性劑相總生物堿的濃度/提取液總生物堿的濃度;

濃縮系數(CF)=濃縮分層后水相體積/表面活性劑相體積。

3 結果與討論

3.1 液-固提取

3.1.1 表面活性劑的選擇

稱取0.25 g 蓮子心粉，分別采用質量分數5%的OP-10、Triton X-100、SDS、SDBS、甲醇、乙醇溶液為提取溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，在壓力200 MPa 下提取2 min，不同提取溶劑對提取率影響如圖1(A)所示。

從圖1(A)可知，OP-10、SDS 比其他溶液具有更高的提取效率，但是SDS 的Krafft 點在8℃左右，后續萃取階段較難控制，而OP-10 的濁點為65～80℃，易于進行后續濁點萃取階段的操作，綜合以上因素最終選擇OP-10 水溶液作為溶劑。

3.1.2 OP-10 水溶液濃度對提取率的影響

稱取0.25 g 蓮子心粉，分別配制質量分數為1%、3%、5%、7%、9%的OP-10 水溶液作為提取溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，在壓力200 MPa 下提取2 min，不同提取溶劑濃度對提取率影響如圖1(B)所示。

表面活性劑具有親水基和疏水基，達到臨界膠束后，可以形成疏水基在里的膠束團，本實驗對蓮心生物堿的提取作用依靠的就是表面活性劑溶液中所形成的膠束。從圖1(B)中可以看出OP-10 質量分數在1%～5%之間，提取率隨著溶劑濃度的增大呈上升趨勢，原因是隨著表面活性劑溶液濃度的增大，形成的膠束越來越多，增溶作用越強，越有利于總生物堿的提取。但在OP-10 質量分數高于5%之后，隨著濃度的增大提取效率呈下降趨勢，這是因為隨著表面活性劑濃度的增大，溶液黏度增大，擴散能力減弱，膠束難滲入到蓮子心樣品基質的內部，導致提取率降低。因此，質量分數5%的OP-10 水溶液為最佳提取溶劑。

3.1.3 壓強對提取率的影響

稱取0.25 g 蓮子心粉，以質量分數5%的OP-10 水溶液為溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，分別在100、200、300、400、500 MPa 高壓下提取2 min，結果見圖1(C)。

超高壓提取的過程是先對物料加壓，保持一定時間后，突然卸壓。由于在增壓過程中，蓮子心細胞內外出現超高壓差，溶劑在壓力作用下迅速滲透到細胞內;卸壓過程中壓力由幾百兆帕迅速降為常壓，同樣，在內外壓差作用下，有效成分從細胞內向周圍溶劑內擴散，從而大大加快了有效成分向外擴散的速率［16］。

從圖1(C)中可以看出，在100～500 MPa 之間，隨著超高壓壓力的升高，提取率略有下降。說明壓力在達到100 MPa 時，細胞的細胞壁和細胞膜已被充分破壞，目標化合物已充分溶出，當壓力增大，溶劑粘度增加，擴散能力減弱，提取率略有下降。因此，提取壓力選擇100 MPa。

3.1.4 保壓時間對提取率的影響

稱取0.25 g 蓮子心粉，以質量分數5%的OP-10 水溶液為溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，100 MPa 高壓下分別提取1、2、3、4、5 min，結果見圖1(D)。

從圖1(D)中可以看出，在1～5 min 之間，隨著保壓時間的延長，提取率略有下降。實驗結果表明，提取溶劑在高壓作用下，進入蓮子心細胞內，100 MPa 高壓下蓮子心的細胞破裂很快，在這1 min 內已經充分破裂，并且超高壓力引起體系的體積變化，推動了化學平衡的移動，溶劑的滲透、溶質的溶解快速達到平衡［16］。從效率和能耗等方面綜合考慮，1 min 為最佳時間。

3.1.5 料液比對提取率的影響

以質量分數5%的OP-10 溶液為溶劑，分別按照料液比1:5，1:10，1:20，1:30，1:40 (g/mL)，100 MPa 高壓下提取1 min，結果見圖1(E)。

如圖1(E)所示，在一定范圍內，隨著料液比的增大，表面活性劑的量增加，膠束作用越強，溶劑對總生物堿的提取效果越好，但是達到一定的濃度后，溶劑實現了對總生物堿的充分提取，再增大料液比提取率基本不變，因此本實驗的最佳料液比為1:20。

圖1 超高壓提取影響因素對提取率的影響Fig.1 Impact of ultrahigh pressure-assisted micellar extraction on the extraction yield of total alkaloids

超高壓輔助表面活性劑提取蓮子心中生物堿的最佳工藝條件如表1 所示，按照上述條件進行提取實驗，蓮心生物堿的提取率可以達到103.6 mg/g。

表1 最佳提取工藝條件Table 1 The optimal conditions of the extraction process

3.2 液-液萃取

3.2.1 NaCl 質量分數對萃取回收率的影響

完成提取后過濾，向濾液中加入一定量的NaCl，使NaCl 的質量分數分別達到5%、10%、12%、15%、17%、20%，恒溫65℃水浴加熱10 min 后，2 000 r/min 離心4 min，結果如圖2(A)所示。

溶液中加入電解質NaCl 可增大OP-10 膠團的聚集數，并降低表面活性劑濃縮相中自由水的質量分數和減少溶質在水相的溶解度，從而提高其對蓮心生物堿的增溶能力并且減小表面活性劑相的體積，另外，無機鹽可以改變非離子表面活性劑的濁點溫度［17］。圖2(A)表明，隨著NaCl 質量分數的增加，濃縮系數一直呈上升趨勢，萃取回收率值在NaCl 質量分數增大到15%后達到平衡，再增加NaCl 的質量分數對萃取回收率值基本沒有影響，而且加入過多的NaCl 難以溶解，因此15%為最佳質量分數。

圖2 濁點萃取各因素對萃取回收率和濃縮系數的影響Fig.2 Impacts of CPE factors on CPE extraction yield and CF

3.2.2 平衡溫度對萃取回收率的影響

完成提取后過濾，向濾液中加入NaCl，使其質量分數達到15%，再分別以恒溫30、40、50、60、65、70℃水浴加熱10 min 后，2 000 r/min 離心4 min，結果如圖2(B)所示。

隨著平衡溫度的上升，膠束中氫鍵斷裂脫水，使表面活性劑富集相體積減少，引發更好的相分離。圖2(B)表明，隨著溫度的上升，濃縮系數一直呈上升趨勢，萃取回收率值在30～50℃間呈上升趨勢，在50℃之后出現下降趨勢，可能是溫度過高，蓮心生物堿穩定性下降，部分生物堿被破壞。所以最佳的平衡溫度是50℃。

3.2.3 平衡時間對萃取回收率的影響

完成提取后過濾，向濾液中加入NaCl，使其質量分數達到15%，分別在50℃恒溫水浴加熱5、10、15、20、25 min 后，2 000 r/min 離心4 min，結果如圖2(C)所示。

在合適的電解質和濁點溫度下，足夠的平衡時間可以使表面活性劑充分的提取富集目標成分。從圖2(C)可知，在50℃恒溫水浴條件下，平衡時間對萃取回收率和濃縮系數影響不大，濃縮系數基本保持不變，萃取回收率值在平衡時間達到10 min 后也基本保持不變。所以平衡時間選擇為10 min。最佳富集工藝條件見表2。

表2 最佳富集工藝條件Table 2 The optimal conditions of the enrichment process

2.3 最優化條件

綜上所述，超高壓輔助膠束提取蓮子心生物堿的最佳提取工藝為提取壓力100 MPa，提取時間1 min，質量分數5% OP-10 為溶劑，料液比1:20 (g/mL)，蓮心生物堿的提取率達到103.6 ±2.6 mg/g。提取液中加入NaCl 使其質量分數達到15%再在50℃條件下平衡10 min，兩相分離，離心后蓮子心生物堿的萃取回收率為70.73% ±1.34%，濃縮系數為8.6 ±0.2。

4 結論

本文利用超高壓輔助膠束提取結合濁點萃取技術從蓮子心中提取富集了蓮心生物堿，與傳統方法相比，超高壓提取時間短、操作簡單、能耗低。同時，超高壓處理后的提取液成分較簡單，不渾濁，粘度低，易過濾，有利于后續操作。常溫提取又能使蓮子心生物堿避免因熱效應損失和藥理活性降低。超高壓輔助膠束提取結合濁點技術是在密閉的環境下常溫進行的，沒有溶劑揮發，綠色環保，是一種提取和富集蓮子心中生物堿的新方法。

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