人睪丸組織TRIM69蛋白具有催化多聚泛素鏈形成的活性

韓永卿，李 容，高晉蘭，繆時英，王琳芳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京100005)

精子發(fā)生的每一個發(fā)育階段，都伴有差異基因精確而有序地表達［1］。因此，深入了解與精子發(fā)生密切相關(guān)的差異表達基因，將有助于揭示生殖及進化的奧秘。

研究表明，泛素化修飾在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用，該修飾過程是通過多種酶級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)的［2］，其中E3泛素連接酶具有特異性識別底物的功能，目前精子發(fā)生過程中已有很多個差異表達基因被鑒定為E3泛素連接酶，其在精子發(fā)生過程中的作用機制正逐漸成為研究熱點［3］。

從人睪丸消減cDNA文庫中擴增到一個差異表達基因，命名為HSD-34，經(jīng)序列比對為人源TRIM69基因編碼區(qū)，該基因編碼的蛋白屬于TRIM家族蛋白，文獻提示TRIM家族很多成員都具有E3泛素連接酶活性［4－6］。該家族蛋白結(jié)構(gòu)特點是含有保守的RING finger結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)泛素化修飾過程中發(fā)揮重要作用，因此推測，TRIM69也具有E3泛素連接酶活性，能夠促進多聚泛素鏈形成。本研究旨在鑒定TRIM69是否具有催化多聚泛素鏈形成的活性，為進一步驗證其是一個新的E3泛素連接酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和重組體構(gòu)建

通過PCR技術(shù)，分別把TRIM69WT(1～1 503 bp)、TRIM69CA(1 ～1 503 bp，C61/64A)、TRIM69ΔR(247～1 503 bp)構(gòu)建到 pcDNA6/V5-HisB載體上;把TRIM69WT(1～1 503 bp)構(gòu)建到pGEX-4T-3載體上以及把HA-Ub構(gòu)建到pMSCVpuro載體上。

1.2 抗體來源

anti-Flag和anti-HA抗體(Sigma-Aldrich公司)，anti-GST抗體(MBL公司)，anti-ubiquitin(P4D1)抗體(Santa Cruz公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染

HEK 293T和HeLa細胞(ATCC公司)，培養(yǎng)基為加有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，細胞在含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。……