甘肅省馬鈴薯壞疽病鑒定及其病原生物學特性研究

姜紅霞，楊成德，薛莉，蒲崇建，陳秀蓉＊，尚勛武，李昌盛

（1.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省植保植檢站，甘肅 蘭州730020；3.甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 甘肅省草業工程實驗室 中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界第四大糧食作物，僅次于小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）。世界上栽培馬鈴薯的國家共有148個，主要分布在亞洲和歐洲等地。目前，我國是世界上最大的馬鈴薯種植國［1］，糧飼兼用，且馬鈴薯塊莖含有一些次生代謝物具有廣泛的生態學效應，如抵御病原微生物侵襲和拒避食草昆蟲采食，在醫療上還具有廣泛的藥理學活性，如抗菌、抗病毒、抗原蟲、抗炎、抗腫瘤、強心、抗膽堿酯酶等［2］；馬鈴薯可以單種，也可以套種，不同栽培方式影響馬鈴薯產量［3］。甘肅省栽培歷史悠久，目前種植面積約6.7萬hm2，87個縣（市、區）中有60個縣種植馬鈴薯，甘肅定西有著“馬鈴薯之鄉”之稱，馬鈴薯是甘肅省各市縣農民解決溫飽和脫貧致富的主導產業之一。然而隨著種植面積的擴大，重茬嚴重，病蟲害發生日益嚴重，已成為限制甘肅省馬鈴薯穩產高產的主要因素之一，特別是馬鈴薯貯藏期病害對馬鈴薯種薯危害嚴重，造成良種損失嚴重，給生產上優良種薯的貯存及供應帶來了顯著影響，如2004年定西市馬鈴薯貯藏期平均病薯率達29.4%。近年來，馬鈴薯貯藏期病害逐年加重，2008和2009年調查，定西市安定區馬鈴薯主裁品種新大坪的脫毒一級種薯爛薯率高達50%以上，新大坪原種平均爛薯率為25.4%，隴薯3號一級種爛薯率10%～15%，嚴重的高達30%左右。經調查，2009年甘肅省部分縣（區）薯塊腐爛的主要癥狀表現明顯不同于晚疫病等以往發生的病害，查閱相關資料，為疑似馬鈴薯壞疽病。馬鈴薯壞疽病主要危害馬鈴薯，是馬鈴薯貯藏期重要病害之一［4］，也可以侵染藜屬（Chenopodium）的一些植物［5］；此病被我國列為對外檢疫對象，目前主要在歐洲、北非、新西蘭、南美和澳大利亞等地［6－9］發生。因此，為了有效地控制該病害，2009和2010年對該病害的病原進行了鑒定，并對其生物學特性及有效化學農藥等進行了室內篩選，以期為甘肅省該病害的綜合防治及馬鈴薯產業的可持續發展提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試標本：2009年3月采集于定西市安定區等地馬鈴薯貯藏庫。

供試儀器：水平凝膠電泳裝置（Bioneer公司）；MyGenie32Thermal Block PCR熱循環儀（Bioneer公司）；凝膠成像系統Uvitec A－6030（Bioneer公司）；高速冷凍離心機（Biometra公司）等。

供試生化試劑：蛋白酶K、DNATaq聚合酶和LD2000Marker購置于上海生工生物技術公司；其他試劑均采用國產分析純。選用通用引物ITS1和ITS4（上海生物工程有限公司合成）為擴增引物，引物序列分別如下：ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G；ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。

供試化學農藥：70%丙森鋅可濕性粉劑（天津市阿格羅帕克農藥有限公司）；70%代森錳鋅可濕性粉劑（天津施普樂農藥技術有限公司）；68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑（先正達作物保護有限公司）；10%苯醚甲環唑水分散粒劑（先正達作物保護有限公司）；32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯懸浮液（先正達作物保護有限公司）；30%丙環唑·苯醚甲環唑乳油（先正達作物保護有限公司）；5%菌毒清（山東勝邦綠野化學有限公司）；35%多菌靈磺酸鹽（新沂中凱農化有限公司）。

1.2 標本采集和分離

2009年3月在甘肅省馬鈴薯主要種植區的貯藏庫采集發病塊莖，進行常規組織分離培養，將分離獲得的真菌鏡檢，莖點霉屬（Phomaspp.）真菌進行致病性測定。

1.3 致病性測定

將分離得到的莖點霉屬分離物配制成106個孢子（菌絲片段）／mL溶液噴霧到帶傷口的馬鈴薯塊莖（品種為新大坪）表面，保濕72h，之后置于15℃培養箱中，定期觀察接菌馬鈴薯塊莖，形成典型癥狀后進行再分離和鑒定，以接種無菌水為對照，經致病性測定具有致病能力的分離物進行以下試驗。

1.4 病原菌的鑒定

形態學及生化鑒定：將病原菌分別接種于馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）、燕麥培養基（OA）和麥芽培養基（MA）上20℃恒溫培養，測量菌落生長速度；光學顯微鏡（10×40倍）下觀察病原菌分生孢子器形態、分生孢子形態和厚垣孢子有無等并照相，測量其大小；根據病原形態特征，參考相關資料［5，7］，確定屬種。將病原菌接種于OA，置于20℃培養箱內培養7d后用氨氣熏蒸［10］和加酸加堿反應［11］，觀察顏色變化情況；將病原菌多點接種于平板OA，觀察菌落間形成的黑線［12］。

ITS序列分析：將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，在25℃、150r／min條件下振蕩培養5～7d后收集菌絲體，采用UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生物工程有限公司）提取病原菌基因組DNA，取5.0μL電泳檢查提取結果。rDNA－ITS的擴增利用真菌核糖體基因轉錄間隔區（ITS）通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。擴增使用50μL擴增體系，即為：10×PCR Buffer 5.0μL，Taq DNA聚合酶（2U／μL）1.2μL，ITS1（10mmol／L）2.0μL，ITS4（10mmol／L）2.0μL，dNTP（10mmol／L）3.0μL，DNA 模板（10ng／μL）2.0μL（以加2.0μL ddH2O為陰性對照），ddH2O 34.8μL。擴增程序：94℃預變性3min，30個循環中，94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸8min。擴增后取5μL擴增產物電泳檢查擴增結果，具特異性條帶的擴增產物送上海生物工程有限公司測序。所測序列進入GenBank數據庫（www.Ncbi.nlm.nih.gov）進行相似性分析，并與GenBank中的相似序列在Claustal（1.81）程序包中進行多重序列匹配排列（Multiple Alignmemts）分析，形成一個多序列匹配排列陣，其中形成的缺口用橫杠“－”填補，用 MEGA（4.0）程序包中的Neighbor－Joining法構建系統發育樹。

1.5 病原菌的生物學特性研究

將純化保存的菌種，在適溫下置PDA培養基培養，參考有關文獻［13－15］進行以下試驗，所得結果采用SPSS數據處理系統進行統計分析。

溫度對菌絲生長的影響：將接菌培養皿置于2，5，10，15，20，25和30℃的溫箱中進行觀察，3d后用十字交叉法每天測量菌落大小。

培養基種類對菌絲生長的影響：將病原菌接種于不同培養基平板中央，置于20℃、黑暗培養，3d后用十字交叉法測量菌落大小，并觀察不同培養基上菌落特征。

溫度對分生孢子萌發的影響：用無菌水配制孢子懸浮液，孢子濃度1.2×105個／mL，懸滴法培養，分別置于2，5，10，15，20，25和30℃7個處理下，每隔2h鏡檢各處理的孢子萌發率，每處理重復3次，鏡檢至少3個視野，100個孢子。

pH值對分生孢子萌發的影響：用磷酸緩沖液將pH值分別調至3，4，5，6，7，8，9和10后配制孢子懸浮液，懸滴法制片，其他同上。

1.6 病原菌的室內毒力測定

根據預試驗結果，供試殺菌劑的試驗濃度見表1。采用生長速率法測定不同藥劑對病原菌的抑制率和計算藥劑對病原菌的抑制率、毒力回歸方程和EC50值［16］。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯壞疽病原的分離與致病性測定

從病薯上直接挑取小黑點進行分離培養，在26份標本中共分離得到8個真菌分離物，將該分離物接種于帶傷口的健康馬鈴薯塊莖，置于15℃下14d后出現了典型癥狀，4～6周在病斑上形成小黑點，經鏡檢與原接種分生孢子器及分生孢子形態一致，而對照上沒有典型癥狀出現。因此，確認所分離到的微生物為該病害的病原菌。而且，經鏡檢，在樣品上所分離得到的8種真菌分離物的培養性狀、菌絲形態、分生孢子和分生孢子器大小及在馬鈴薯上引起的癥狀均一致，因此，認為多份樣品上的分離物為同一種微生物，則將該分離物確定為病原物進行以下試驗。

2.2 馬鈴薯壞疽病原的鑒定

2.2.1 形態特征及生化鑒定 對分離得到的病原菌在PDA培養基上培養7～9d，后轉到5℃條件下培養大約30d后出現分生孢子器，鏡檢分生孢子器褐色，球形、扁圓形，散生或多個聚集，具孔口，內生大量分生孢子（圖1－1），遇水或擠壓后分生孢子像擠牙膏式的從孔口涌出，分生孢子橢圓形或卵園形，單胞、無色，偶雙胞，有的兩端各具2個油球（圖1－2），在PDA培養基上分生孢子大小為2.5～4.4μm×4.7～9.2μm，分生孢子器大小為82～210μm×64～175μm，厚坦孢子球形或近球形，多串生（圖1－3），大小為27～81μm×18～63μm。此與文獻報道［5］的Phoma foveata 的特征一致。

該病原菌在麥芽培養基上培養后用氨氣熏蒸可變為紅色，在麥芽培養基上培養后先加堿（氫氧化鈉），約10 min后培養基及堿液均變為紅色，再加酸之后約30s培養基及酸液均變為黃色，時間越長，黃色越明顯；在OA平板上不同菌落間可以形成黑線，且后期可以形成黃綠色針狀結晶體。

該病原菌在PDA和燕麥培養基上生長速率不一致，在PDA培養基上生長較快，7d后滿皿，在燕麥培養基和麥芽培養基上生長較慢，7d為7.1cm。

根據病原形態、病原生長速率、生化反應和致病性測定結果，參考相關文獻［4－6，11］，鑒定此病原菌為Phoma foveata，該病害為馬鈴薯壞疽病。

圖1 病原形態Fig.1 Morphology of pathogens

2.2.2 ITS序列分析 采用UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取壞疽病菌基因組DNA，經電泳檢測，其特異性和純度等能滿足PCR擴增反應的要求（圖2）。

在引物ITS1和ITS4的引導下，PCR擴增30個循環，產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker－DL2000為對照，在500bp處有1條明顯的特異性擴增條帶，即為獲得的目的ITS rDNA片斷（圖3），將該擴增產物送上海生工測序。

圖2 壞疽病菌基因組DNA電泳Fig.2 Electrophoretic pattern of the total DNA of P.foveata

圖3 壞疽病菌ITS rDNA PCR電泳Fig.3 Electrophoretic pattern of ITS rDNA sequence of P.foveata

將所測定的壞疽病菌的ITS rDNA序列輸入GenBank中比對后，搜索下載同源性最高的序列，與GenBank中的菌株P.foveataAJ301723、P.foveataGU237742等7個序列使用Claustle（1.8）進行多重序列比較，再用 Mega 4.0軟件以最大簡約法（Neighbor－Joining，NJ）構建系統發育樹，壞疽病菌在系統發育樹中與各菌株的同源性都在99%以上，其中與P.foveataGU237742同源性達100%，說明其親緣關系最近（圖4）。

圖4 馬鈴薯壞疽病菌系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of P.foveata

圖5 溫度對菌絲生長的影響Fig.5 Effect of temperature on colony growth

2.3 生物學特性研究

2.3.1 溫度對菌絲生長的影響 在2～30℃條件下，該菌菌絲均能生長，但除10℃至25℃之間外不同溫度間均差異顯著（P＜0.05）。在20℃時7d菌落直徑達80.1mm，顯著高于其他溫度處理（P＜0.05），說明20℃是該菌菌絲生長的最適宜溫度，但高溫明顯抑制菌絲的生長（圖5）。

2.3.2 培養基對菌絲生長的影響 在PDA培養基上菌落直徑（75.9mm）顯著大于其他培養基（P＜0.05），PSA培養基上其次，而在馬丁氏培養基上菌落直徑（33.6mm）顯著小于其他培養基（P＜0.05）。說明不同培養基對該菌菌絲的生長有影響，其中PDA培養基最適宜其生長，而馬丁氏培養基則不利于其生長（圖6）。

該菌在不同培養基上的菌落特征有差異，具體如下：

PDA：從菌落的背面觀察為黃色，正面為灰色，菌落邊緣整齊，較厚，表面有不明顯輪紋。

PSA：從菌落的背面觀察為黃色，正面為灰白色，表面有明顯的輪紋，邊緣整齊，較厚。

馬丁氏培養基：菌落正反面均為白色，氣生菌絲疏松，老菌絲顏色較深，為灰色，菌落邊緣整齊，質地薄，菌餅上有氣生菌絲。

燕麥培養基：菌落正反面均為白色，氣生菌絲疏松，菌落較薄，邊緣整齊，菌餅上氣生菌絲較多。

麥芽糖培養基：菌落正反面均為灰色，氣生菌絲疏松，菌落較厚，邊緣呈放射狀，菌餅上氣生菌絲較多。

玉米粉培養基：從菌落反面觀察為黃色，正面為灰色，氣生菌絲少，菌落較薄，邊緣整齊，菌餅上有較多氣生菌絲。

查理固體培養基：從菌落反面觀察為黃色，正面為灰色，有紅色色素產生，菌落表面有不規則的輪紋，邊緣不規則，菌餅上有較多氣生菌絲。

查彼固體培養基：菌落正反面均為白色，較薄，邊緣不規則，老菌絲顏色深，菌餅上有氣生菌絲。

2.3.3 溫度對分生孢子萌發的影響 馬鈴薯壞疽病菌分生孢子在2～30℃內均可萌發，其中在2，5和30℃間差異不顯著（P＞0.05），且顯著低于其他溫度處理（P＜0.05），20℃下孢子萌發率顯著高于其他溫度條件（P＜0.05）。該結果說明馬鈴薯壞疽病菌分生孢子萌發溫度范圍較廣，但高溫明顯抑制孢子的萌發，且分生孢子萌發最適溫度與菌絲生長最適溫度一致，均為20℃（圖7）。

2.3.4 pH值對分生孢子萌發的影響 馬鈴薯壞疽病菌分生孢子在pH值為3～10時均能萌發，在pH值為3，8，9和10時萌發率介于11%～13%，顯著低于其他溫度處理（P＜0.05），在pH值為6時，萌發率可達29%，顯著高于其他溫度處理（P＜0.05）。該結果說明，pH為6時，有利于分生孢子的萌發；總體上酸性有利于分生孢子的萌發，堿性時分生孢子也能萌發，但萌發率較低，即該分生孢子對酸堿度適應性強，但更適宜偏酸性條件（圖8）。

圖6 培養基對菌絲生長的影響Fig.6 Effect of meadia on colony growth

圖7 溫度對孢子萌發的影響Fig.7 Effect of temperature on germination ratio

圖8 pH對孢子萌發的影響Fig.8 Effect of pH value on germination ratio

2.4 病原菌的室內毒力測定

2.4.1 化學藥劑對菌絲生長的影響 8種藥劑對馬鈴薯壞疽病菌均有抑制作用，其中10%苯醚甲環唑WG、5%菌毒清AS、32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯SE、70%代森錳鋅WP、30%丙環唑·苯醚甲環唑EC、35%多菌靈磺酸鹽 WP、68%精甲霜·錳鋅 WG和70%丙森鋅WP，在其濃度下對馬鈴薯壞疽病菌的相對抑制率均較高，除68%精甲霜·錳鋅WG和70%丙森鋅WP外其抑菌率均在90%以上（表1）。

表1 8種殺菌劑對馬鈴薯壞疽病菌的相對抑制率Table 1 The inhibition effect of different fungicides on hypha growth of P.foveata

2.4.2 8種殺菌劑的毒力比較 對馬鈴薯壞疽病菌的室內毒力測定結果表明，30%丙環唑·苯醚甲環唑EC、35%多菌靈磺酸鹽WP、5%菌毒清AS、10%苯醚甲環唑WG、32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯SE、70%丙森鋅 WP、70%代森錳鋅 WP和68%精甲霜·錳鋅 WG，8種藥劑的EC50值分別為2.43×10－5，1.77×10－2，7.40×10－2，1.31×10－1，2.31×10－1，1.10，2.90和2.46×102μg／mL。其中，供試馬鈴薯壞疽病原菌對30%丙環唑·苯醚甲環唑EC特別敏感，其EC50的值為2.43×10－5μg／mL，對68%精甲霜·錳鋅 WG最不敏感，EC50的值為2.46×102μg／mL（表2）。

表2 12種殺菌劑對馬鈴薯壞疽病菌的毒力測定Table 2 The toxicity determination of different fungicides to potato gangrene caused by P.foveata

3 結論與討論

馬鈴薯壞疽病為國外報道的馬鈴薯貯藏期重要病害之一［4］，其主要寄主為馬鈴薯，也可以侵染藜屬的一些植物［5］；其在歐洲、北非、新西蘭、南美和澳大利亞等多個國家［6－9］發生。近年來，在冷涼地區，馬鈴薯貯藏期干腐病（Fusariumspp.）逐漸下降，而壞疽病卻在上升，且由于種薯分級等造成大量傷口及長時間的貯存發生更嚴重，在田間一般發生較輕，但種植發病輕重的種薯也可以引起20%的產量損失及小薯增加［7］，現被我國列為進境檢疫性有害生物，在我國系首次詳細報道。1967年Boerema［11］認為馬鈴薯壞疽病菌P.foveata與馬鈴薯貯藏期的另一病原菌P.exigua在形態上一致，只是前者產生色素，而后者不產生色素，因此將其歸入P.exigua下的一個變種，即為P.exiguavar.foveata，但在1987年Boerema等［17］認為P.exigua和P.exiguavar.foveata間形態及致病力等方面差異較大，建議恢復其P.foveata的名稱，即在1940年到1967年及1987年后病原拉丁學名為P.foveata，鑒定主要以形態特征為依據，在1967到1987年間病原拉丁學名為P.exiguavar.foveata，在形態特征鑒定的基礎上以生化特性及寄主范圍為依據進行鑒定，在生化特性中主要特征是蒽醌色素的有無，如Boerema等［11］1967年報道了該病害病原菌所產生色素在酸性條件下變黃，在堿性條件下變紅；在半選擇培養基上菌株間可以形成黑線［12］；在1%麥芽培養基中加入25mg／kg的甲基托布津不僅可加速形成黃色晶體（色素），且增加了數量，同時兩變種在培養性狀上差異很大［18］；P.foveata在PDA培養基上可形成蒽醌色素，因此將病組織或純培養在溶漿機中搗碎，并用氯仿浸提，浸提液在55℃蒸發，后噴于硅膠板層析（層析液為甲苯∶丙酮＝95∶5，v／v），后在波長為366nm下觀察，可看到特異性條帶，且與商品大黃酸中的部分成分一致，將10%的KOH甲醇液噴于其上，條帶變紅［19］；培養的該菌經氨氣熏蒸，可使蒽醌色素變紅［10］；Weijman等［20］報道了用氣相色譜法診斷該病害的方法，認為比以前分離病原物鑒定或用硅膠板鑒定蒽醌色素要靈敏和具有特異性，但其本質仍然是鑒定所產生的色素；只有Virgilio等［21］報道了用RAPD方法區分P.exigua和P.foveata，即從遺傳上區分這兩個種。本試驗中，按參考文獻［5］，以形態學結合蒽醌色素特征為主要依據進行了傳統鑒定，同時利用ITS序列進行了同源性分析，壞疽病菌在系統發育樹中各菌株的同源性都在99%以上，其中與P.foveataGU237742同源性達100%，說明其親緣關系最近。

該病原菌菌絲生長速率及分生孢子萌發率均在20℃時最高；在不同培養基上菌落形態及生長速率均有差異，其中在PDA培養基上生長最快；在pH值為6時分生孢子萌發率最高，且偏酸性有利于該病原菌分生孢子的萌發。目前，在防治馬鈴薯貯藏期病害上使用的高效藥劑并不多，本試驗室內毒力測定中30%丙環唑·苯醚甲環唑EC、35%多菌靈磺酸鹽、5%菌毒清、10%苯醚甲環唑 WG、32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯SE、70%丙森鋅WP、70%代森錳鋅的毒力系數均較小，理論上均為較好的防治藥劑，但室內的毒力測定結果僅僅說明殺菌劑對在離體條件下對馬鈴薯壞疽病菌的直接活性，不能顯示不同藥劑在田間應用效果，所以這些藥劑還需在大田進一步試驗篩選。

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