單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液的制備工藝

羅 宏 鄒意瓊

（西南藥業股份有限公司 藥物研究所，中國 重慶400038）

單唾液酸四己糖神經節苷脂（monosialoganglioside，簡稱GM1）在哺乳動物中樞神經系統中神經節苷脂含量豐富，其中以神經系統灰質含量最高。 GM1 是神經細胞膜的重要組分，是唯一能透過血腦屏障的外源性神經節苷脂制劑[1]。 GM1 能促進各種原因所致中樞神經系統損傷的功能恢復，對損傷后繼發性神經退化有預防作用[2]。動物實驗已證明[3－4]，在腦損傷早期給予單唾液酸四己糖神經節苷脂治療，可提高平均動脈壓，保護腦組織內Ca2+－ATP 酶活性，起到穩定細胞膜的作用，防止細胞內鈣超載，改善腦組織缺血缺氧，加強能量代謝，從而減輕腦水腫，阻斷繼發性腦損傷的發展。另外，單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉是一種神經修復藥物，它可以清除自由基、保護多巴胺能神經元，從而減輕帕金森病（Parkinsin's Disease，PD）患者的癥狀[5]。 因此，臨床上GM1 主要用于治療急性中樞神經系統損傷以及帕金森病。

GM1 由一個唾液酸，一個葡萄糖，二個半乳糖，一個氨基半乳糖及一個神經酰胺殘基組成，具有水溶性和脂溶性，GM1 鈉鹽具有較好的水溶性。 且對熱穩定性較好。 因此，將GM1 做成注射劑。 按照注射劑的質量標準，性狀、可見異物、不溶性微粒、細菌內毒素、無菌、有關物質和含量必須符合質量標準。目前，應用臨床上的GM1 制劑主要是從豬腦中提取出來的，原料中除GM1 外，還有雜蛋白、GM2、GD3和其它雜質等。 這些雜質都會對GM1 注射劑質量有影響。 因此，需要摸索GM1 注射劑的生產工藝， 使之盡量除去雜蛋白對注射劑澄清度的影響，同時減少有關物質的量。

1 試驗材料

1.1 藥品與試劑

單唾液酸四己糖神經節苷脂雜質對照品（由中國藥品生物制品檢定所提供）；單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液（以下簡稱GM1 注射液，自制）；單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉（湖南賽隆藥業有限公司）；氯化鈉（自貢鴻鶴藥業有限公司）；針用活性炭（上海活性炭廠）；磷酸（重慶川東化工有限公司）；乙晴（成都金山化學試劑有限公司）和四氫呋喃（天津市光復精細化工研究所）等。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（安揭倫科技公司）、pH 計（上海雷磁儀器廠）、紫外分光光度計（安揭倫科技公司）、不溶性微粒檢測儀（北京東方森聯自動化技術有限公司）和澄明度檢測儀（天津大學精密儀器廠）等。

2 方法與結果

2.1 GM1 注射液的制備

先加入配置總量80%的注射用水， 注射用水溫度控制在75-85℃，將氯化鈉等輔料溶解后，再加入單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉原料，,攪拌溶解。 最后加入活性炭，并保溫20 分鐘，待藥液冷卻后，用氫氧化鈉溶液調pH，通過115℃滅菌30min 后，得到單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液。

2.2 GM1 含量測定

照高效液相色譜法（中國藥典2010 年版二部附錄VD）測定。

色譜條件及系統適用性試驗： 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.05mol/L 磷酸溶液（用三乙胺調節pH 至3.5）-乙腈（15：85）為流動相；檢測波長為205nm；理論塔板數按單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉峰計算應不低于500。

測定法： 精密移取單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液1mL 置于25mL 容量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液（濃度為0.4mg/mL）；另取工作對照品適量，精密稱定，用水定量稀釋成每1mL中約含0.4mg 的溶液，作為對照品溶液，分別取供試品溶液和對照品各溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，用外標法計算，單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉的含量應為標示量的90.0-110.0%。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果分析表

2.3 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液制備工藝的考察

2.3.1 有關指標

①藥液滅菌后pH 測定： 參照 《中國藥典》2010 版二部附錄ⅥH pH 測定法。 ②藥液可見異物檢查：按照《可見異物檢查細則和判斷標準》的規定檢查，應符合規定。 ③有關物質的測定：有關物質用高效液相法測定，單雜應不超過1.0%，總雜應不超過5%。 ④GM1 含量測定：用高效液相法測定GM1 的含量，含量應在90%～110%范圍內。

表3 實驗結果表

表4 高溫、光照試驗結果

2.3.2 正交試驗結果：根據以上實驗設計方案，對單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液工藝影響較大的幾個方面如藥液配制溫度、活性炭、滅菌溫度進行正交設計試驗，以篩選最佳處方，如表1。 結果見表2。

由表2 可知，對單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液含量的影響因素B〉C〉A，并得知最佳方案為A3B1C3。

2.3.3 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液質量檢測：按照A3B1C3方案在公司小容量注射劑車間中試放大三批， 藥液經過0.45μm 和0.22μm 兩級過濾，灌封后通過115℃滅菌30min，樣品經過質量檢測，結果見表3。 并且檢驗合格的第三批樣品放置在高溫（60±2）℃，相對濕度（75±5）% ；光照（4500±500）Lx 條件下10d，于第5、第10 天取樣檢測，結果見表4。 可見，用A3B1C3方案制備的注射液結果較好。

3 討論

3.1 GM1 是從豬腦中提取出的物質，原料中除GM1 外，還有雜蛋白、GM2、GD3和其它雜質等。 這些雜質都會對注射劑質量有影響。 因此必須在配制過程中保持一定溫度，使原料中的雜質通過高溫變性，并且加適量活性炭將雜質和變性后的雜蛋白除去， 同時要保證注射劑無菌，需要滅菌。

3.2 在配制過程中將藥液溫度控制在75-85℃，以除去雜蛋白。 GM1原料中有雜蛋白，雜蛋白如果控制不好，影響藥液的可見異物，根據蛋白質的性質，選擇加熱使蛋白質變性。 再通過加入活性炭吸附和過濾方式除去蛋白質。

3.3 活性炭有吸附雜質、 除去熱原等作用。 GM1 注射液中加入活性炭，將變性后的蛋白質和其它雜質除去，保證藥液可見異物符合規定，同時降低有關物質的量。 注射劑中活性炭常用量為0.01-0.5%。 但活性炭同時對GM1 有吸附作用。為保證主藥含量的準確性，進行了不同濃度活性炭對主藥的吸附的考察，從試驗結果表明，活性炭的用量為0.01%，既保證主藥含量，又能使藥液可見異物符合標準規定。

3.4 滅菌溫度的確定：根據注射劑的要求，對熱穩定的產品，其F0值必須大于8，最好采用過度殺滅法，按此要求，選擇不同的滅菌溫度試驗，結果是采用過度殺滅法有關物質中單雜明顯升高，且不符合標準規定，而采用殘存概率法滅菌，其質量均符合標準規定，因此，滅菌溫度確定為115℃滅菌30 分鐘。

［1］姜靜巖，范雪亮，等.單唾液酸四己糖神經節苷脂治療顱腦損傷的臨床觀察[J].西南國防醫藥，2012，22（2）：144-146.

［2］姜靜巖，劉順良，李慧，等.單唾液酸四己糖神經節苷脂治療急性顱腦損傷201 例[J].臨床醫藥，2011，20（7）：54-55.

［3］陳志剛，盧亦成，朱誠，等.神經節苷脂GM1 在顱腦損傷早期的腦保護作用[J].第二軍醫大學學報，2002，23（4）：420－422.

［4］Ledeen RW，Wu G.Nuclear lipids: key signaling effectors on the nervoussystem and other tissues [J].J Lipid Res，2004（45）：1－8.