利福平和異煙肼結(jié)核分枝桿菌藥敏表型和基因型的關(guān)系

劉厚明 陳建波 肖顏玉 吳馳 葉飛娣 蔡舒豪 趙艷敏 鄧群益 單萬(wàn)水

·論 著 ·

利福平和異煙肼結(jié)核分枝桿菌藥敏表型和基因型的關(guān)系

劉厚明 陳建波 肖顏玉 吳馳 葉飛娣 蔡舒豪 趙艷敏 鄧群益 單萬(wàn)水

目的 對(duì)利福平（RFP）和異煙肼（INH）進(jìn)行藥敏檢測(cè)，分析相應(yīng)的結(jié)核分枝桿菌藥敏表型與基因型的關(guān)系。方法 對(duì)2009年至2012年深圳市第三人民醫(yī)院結(jié)核病門(mén)診和住院的137例結(jié)核病患者晨痰標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，利用膜基因芯片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的突變情況（基因型檢測(cè)），同時(shí)以絕對(duì)濃度法進(jìn)行異煙肼和利福平藥敏試驗(yàn)（表型檢測(cè)），計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果間的符合率，驗(yàn)證膜基因芯片方法的準(zhǔn)確性，用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法的一致性。結(jié)果 137株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本，表型檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥率分別為27.01%（37/137）和22.63%（31/137）；基因型檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥率分別為26.28%（36/137）和23.36% （32/137）；以絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，膜基因芯片檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為83.78%（31/37），特異度為94.06%（95/101），符合率為91.97%（126/137），Kappa值為0.79，P＜0.05；異煙肼耐藥的敏感度為80.65% （25/31），特異度為94.29%（99/105），符合率為90.51%（124/137），Kappa值為0.73，P＜0.05；兩種藥物藥敏結(jié)果總符合率為91.24%（250/274）。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌耐藥性基因型檢測(cè)和表型檢測(cè)結(jié)果高度一致，且基因型的檢測(cè)方法能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性，有望在臨床治療中廣泛應(yīng)用。

分枝桿菌，結(jié)核； 微生物敏感性試驗(yàn)； 利福平； 異煙肼； 表型； 基因型； 寡核苷酸序列分析

結(jié)核病為結(jié)核分枝桿菌侵入人體后引起的一種具有強(qiáng)傳染性的慢性消耗性疾病。據(jù) WHO統(tǒng)計(jì)，全世界有十幾億人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)患者1000萬(wàn)例，并有將近200萬(wàn)例死亡，為傳染病死亡例數(shù)的第一位，耐藥菌株流行是結(jié)核病疫情日趨嚴(yán)重的主要原因［1-3］。目前用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)的方法大多時(shí)間較長(zhǎng)，以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的絕對(duì)濃度法或比例法需要4周時(shí)間才能得到藥敏結(jié)果［4］，故結(jié)核病患者通常不能得到及時(shí)有效的治療，導(dǎo)致耐多藥結(jié)核病患者結(jié)核分枝桿菌的增殖和傳播。因此，需要建立一種操作簡(jiǎn)便、快速的藥物敏感試驗(yàn)方法，這對(duì)于控制耐多藥結(jié)核病的傳播具有重要意義。利用反向斑點(diǎn)雜交的原理建立膜基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐利福平和異煙肼藥物基因，該方法2 d就能出結(jié)果，但其與傳統(tǒng)藥敏方法的準(zhǔn)確性比較少有報(bào)道。本研究以絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)膜基因芯片檢測(cè)結(jié)果與絕對(duì)濃度法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的符合率，并探討該方法在臨床診斷中的應(yīng)用前景。

材料和方法

1.標(biāo)本來(lái)源：2009年至2012年6月深圳市第三人民醫(yī)院結(jié)核病門(mén)診和住院結(jié)核病患者137例，其中男81例，女56例，年齡介于2～82歲之間，中位年齡為40歲，留取2份晨痰標(biāo)本，分別做結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，異煙肼和利福平藥敏試驗(yàn)及結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)。所有患者診斷均依據(jù)2006年版《臨床診療指南結(jié)核病分冊(cè)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診［5］，經(jīng)晨痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核病患者。

2.試劑和儀器：分枝桿菌藥敏試驗(yàn)羅氏培養(yǎng)管購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司：利福平藥物低、高濃度分別為50μg/L、250μg/L，異煙肼藥物低、高濃度分別為1μg/L、10μg/L。結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司），TY-80R脫色搖床（上海比朗儀器有限公司），F(xiàn)YY-3型分子雜交儀雜交（興化市分析儀器廠）。

3.結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼藥敏試驗(yàn)：每份菌液配置成1mg/ml的菌液，10倍稀釋至10-2mg/ml，混勻后吸取菌液0.1 ml，均勻接種于每種藥物的高、低濃度2只培養(yǎng)基上，同時(shí)接種不含藥的培養(yǎng)基0.1 ml為生長(zhǎng)對(duì)照，以空白培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為質(zhì)控株（本室保存），每周觀察1次，至少4周報(bào)告結(jié)果。以對(duì)照管生長(zhǎng)結(jié)核分枝桿菌，空白管無(wú)生長(zhǎng)，質(zhì)控株“結(jié)果在控”。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)有效，高、低濃度的兩份培養(yǎng)基斜面同時(shí)生長(zhǎng)結(jié)核分枝桿菌菌落為耐藥；低濃度培養(yǎng)基生長(zhǎng)而高濃度培養(yǎng)基未生長(zhǎng)結(jié)核分枝桿菌菌落為中介；高、低濃度的培養(yǎng)基均未生長(zhǎng)結(jié)核分枝桿菌菌落為敏感。

4.膜基因芯片法檢測(cè)耐藥基因突變：結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。檢測(cè)rpoB基因野生型和突變型位點(diǎn)511、513、516、522、523、526、529、531和533，檢測(cè)katG基因野生型和突變型位點(diǎn)315，檢測(cè)inhA基因野生型和突變型位點(diǎn)-15。從臨床樣本或純培養(yǎng)物中提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA，取出PCR反應(yīng)液Ⅰ和PCR反應(yīng)液Ⅱ各一管，在管壁上做好標(biāo)記，用相對(duì)離心力400×g離心2 s后加入4μl DNA樣品上清液作為PCR擴(kuò)增模板，相對(duì)離心力400×g離心2 s。每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置測(cè)序分析已知突變株（實(shí)驗(yàn)室保存）作為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增程序：50℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 min；95℃45 s，68℃1 min，30個(gè)循環(huán)；95℃30 s，54℃30 s，68℃1 min，30個(gè)循環(huán)；最后68℃5 min延伸。擴(kuò)增完成后雜交按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

5.對(duì)利福平敏感但雜交突變的5株結(jié)核分枝桿菌的測(cè)序結(jié)果：在傳統(tǒng)方法利福平敏感的100株結(jié)核分枝桿菌菌株中，膜芯片雜交法有5株檢出有突變，將此5株菌送至華大（深圳）基因研究院對(duì)rpoB基因進(jìn)行測(cè)序分析。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以絕對(duì)濃度法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算兩種方法的符合率。用χ2檢驗(yàn)分析絕對(duì)濃度法藥敏結(jié)果和膜基因芯片雜交檢測(cè)利福平和異煙肼基因位點(diǎn)的結(jié)果的差異性，P＞0.05提示兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法的一致性，即1≥Kappa≥0.75時(shí)提示高度一致性，0.75＞Kappa≥0.4時(shí)提示中度一致性，Kappa＜0.4時(shí)提示低度一致性。對(duì)Kappa值進(jìn)行U檢驗(yàn)，P＜0.05提示可認(rèn)為兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有一致性。

結(jié) 果

1.結(jié)核分枝桿菌絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果：為方便與膜基因芯片檢測(cè)結(jié)果比較，本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果將中介歸納為耐藥進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利福平耐藥率為27.01% （37/137），異煙肼耐藥率為22.63%（31/137）。

2.結(jié)核分枝桿菌膜基因芯片檢測(cè)結(jié)果：利福平耐藥（突變型）率為26.28%（36/137），有21株531位點(diǎn)突變，8株526位點(diǎn)突變，6株516位點(diǎn)突變，還有1株511和513位點(diǎn)的缺失。異煙肼耐藥率（突變型）為23.36%（32/137），23株315位點(diǎn)突變，有8株-15位點(diǎn)突變，還有1株inh A基因位點(diǎn)缺失。

3.絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)與膜基因芯片雜交檢測(cè)的結(jié)果比較：經(jīng)χ2檢驗(yàn)，利福平和異煙肼P值均是1，提示兩種方法檢驗(yàn)此兩種藥物結(jié)果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以絕對(duì)濃度法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，膜基因芯片雜交檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為83.78% （31/37），特異度為94.06%（95/101），符合率為91.97%（126/137）；膜基因芯片雜交檢測(cè)異煙肼耐藥的敏感度為80.65%（25/31），特異度為94.29% （99/105），符合率為90.51%（124/137）；兩種藥物的總符合率為91.24%（250/274）。具體見(jiàn)表1、2。

利福平一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.79，＞0.75，P2＜0.05，可認(rèn)為兩種方法具有高度一致性；異煙肼的一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.73，結(jié)果＜0.75而＞0.4，P2＜0.05，可認(rèn)為兩種方法具有中度一致性。

4.對(duì)利福平敏感但雜交突變的5株結(jié)核分枝桿菌的測(cè)序結(jié)果：經(jīng)測(cè)序證實(shí)對(duì)利福平敏感但雜交突變的5株結(jié)核分枝桿菌rpoB基因都有突變（圖1）。

討 論

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)抗結(jié)核藥物的作用位點(diǎn)及 Mtb耐藥機(jī)制，尤其對(duì)利福平和異煙肼等一些常用的抗結(jié)核一線藥物的耐藥機(jī)制已經(jīng)有了較深入的了解，認(rèn)為 Mtb耐藥性的發(fā)生與耐藥相關(guān)基因突變有關(guān)［6-9］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，耐藥性的產(chǎn)生與rpoB基因的突變有關(guān)。突變使編碼RNA聚合酶β亞單位少數(shù)高度保守的氨基酸置換，空間構(gòu)象發(fā)生變化，阻止了與利福平的結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥［6］。對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)與katG和inh A基因突變有關(guān)。katG基因編碼結(jié)核分枝桿菌過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶，若katG基因發(fā)生突變，有可能導(dǎo)致異煙肼活化效率降低或不能活化，從而引起結(jié)核分枝 桿菌 對(duì)異 煙肼 產(chǎn) 生不 同程 度的 耐藥 性［7］。inh A基因編碼脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NADH依賴的enoyl-ACP還原酶），是分枝菌酸細(xì)胞壁合成的必需成分，活化的異煙肼結(jié)合到NADH上抑制了依賴NADH酶的活性，抑制了分枝菌酸的合成而導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。inh A基因的突變修改了該酶，使它失去和NADH的親和力，導(dǎo)致異煙肼耐藥［8-9］。因此，這些區(qū)域是利福平和異煙肼耐藥株分子檢測(cè)的主要靶位［10-12］。

表1 膜基因芯片法與絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥結(jié)果的對(duì)比分析

表2 膜基因芯片法與絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)異煙肼耐藥結(jié)果的對(duì)比分析

圖1 對(duì)利福平敏感但雜交突變的5株結(jié)核分枝桿菌測(cè)序圖

本研究結(jié)果表明利福平膜芯片檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)的絕對(duì)濃度法的藥敏檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法的一致性，利福平一致性試驗(yàn)Kappa值為0.79，＞0.75，P2＜0.05，顯示2種方法具有高度一致性。本研究耐藥株rpoB基因突變檢出率為83.78%（31/37），略低于文獻(xiàn)報(bào)道約90%耐藥株有rpoB基因的突變［13-14］，可能因rpoB基因突變?cè)谖稽c(diǎn)檢測(cè)之外引起。本研究36株結(jié)核分枝桿菌膜芯片雜交法都耐藥的菌株中，有21株531位突變，8株526位突變，6株516位突變，還有1株511和513位點(diǎn)的缺失。突變序位頻率531＞526＞516與Lee等［13］報(bào)道相同，但與Sajduda等［15］報(bào)道的531＞516＞526略有差異，突變序位差異可能與研究的標(biāo)本數(shù)少有關(guān)，也可能存在地區(qū)差異。值得注意的是在傳統(tǒng)方法利福平敏感的100株菌株中，膜芯片雜交法有5株檢出有突變，經(jīng)測(cè)序證實(shí)5株菌rpoB基因都有突變（圖1），可能此5株突變基因不表達(dá)而致傳統(tǒng)藥敏敏感。在膜芯片法利福平敏感的101株菌株中，傳統(tǒng)方法有6例耐藥，可能是因?yàn)槟ば酒ㄖ话哳l的耐藥探針基因，不包含臨床上突變頻率較低的耐藥突變探針有關(guān)；或測(cè)定其 MIC值，有可能是一種低度耐藥表型，通過(guò)上述途徑，可以縮小兩種方法間的差異。

本研究對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)結(jié)果也顯示，膜芯片檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)的絕對(duì)濃度法的藥敏檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法的一致性，異煙肼的一致性試驗(yàn)Kappa值為0.73，結(jié)果＜0.75但＞0.4，P2＜0.05，可認(rèn)為兩種方法具有中度一致性。異煙肼耐藥株katG基因315位點(diǎn)突變率為71.88%（23/32），inh A基因-15位點(diǎn)突變率為25.0%（8/32），還有1株inh A基因位點(diǎn)缺失。目前明確的結(jié)核分枝桿菌突變耐藥基因有幾十個(gè)位點(diǎn)之多，本方法選取耐藥頻率較高的11處基因位點(diǎn)檢測(cè)。因只檢測(cè)11個(gè)上述2種藥突變耐藥基因位點(diǎn)，沒(méi)有檢測(cè)到突變耐藥基因位點(diǎn)并不表明沒(méi)有11個(gè)位點(diǎn)之外的突變耐藥基因。這也可能是2種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的原因。

膜基因芯片法對(duì)利福平和異煙肼檢測(cè)的結(jié)果與絕對(duì)濃度法結(jié)果對(duì)比，符合率分別為91.97% （126/137）和90.51%（124/137），總符合率為91.24%（250/274），提示與絕對(duì)濃度法藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果差異不大，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［16］。本研究采用反向點(diǎn)雜交膜基因芯片檢測(cè)技術(shù)是一種建立于PCR基礎(chǔ)上的反向點(diǎn)雜交方法。其原理是應(yīng)用生物素修飾的特異引物擴(kuò)增DNA，使PCR產(chǎn)物帶有生物素標(biāo)記，將PCR產(chǎn)物變性后與固定在膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過(guò)觀察斑點(diǎn)雜交信號(hào)強(qiáng)弱判斷結(jié)果。其探針數(shù)目多，可以同時(shí)檢測(cè)到2種藥物耐藥基因型，分析rpoB基因、katG基因和inh A基因，能檢出2種藥物的絕大部分耐藥突變株，檢測(cè)時(shí)間僅需1 d，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏方法高度一致，具有快速、準(zhǔn)確和特異的特點(diǎn)，且在時(shí)效性方面大大優(yōu)于絕對(duì)濃度法藥敏，顯示了膜基因芯片法在臨床耐藥結(jié)核病的診療中有廣闊的應(yīng)用前景。但絕對(duì)濃度法藥敏方法在目前仍無(wú)法完全被取代，兩者結(jié)合使用將為臨床治療工作提供可靠的保證。

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The relationship of drug susceptibility phenotype and genotype of Mycobacterium tuberculosis for rifampin and isoniozid

LIU Hou-ming，CHEN Jian-bo，XIAO Yan-yu，WU Chi，YE Fei-di，CAI Shu-hao，ZHAO Yan-min，DENG Qun-yi，SHAN Wan-shui. Laboratory of Shenzhen Third People’s Hospital，Affiliated of Guangdong Medical College，Shenzhen 518112，China

LIH Hou-ming，Email：eric120@126.com

Objective Analysis drug susceptibility phenotype and genotype of Mycobacterium tuberculosis （Mtb）to rifampin（RFP）and isoniozid（INH）.Methods One hundred and thirty-seven morning sputum specimens were cultured for Mycobacterium tuberculosis at Shenzhen Third People’s Hospital from 2009 to 2012，Use membrane gene chip test technology to detect the mutation type of RFP and INH resistance gene，absolute concentration drug susceptibility test were performed at the same time，calculate the coincidence rate between membrane gene chip test results and the absolute concentration drug susceptibility test，to verify the accuracy of the membrane gene chip method.Results The ratio of phenotype drug-resistant for RFP and INH were 27.01（37/137）and 22.63% （31/137），the ratio of genotype drug-resistant for RFPand INH were 26.28（36/137）and 23.36%（32/137）.Compared with the gold standard of absolute concentration drug susceptibility test，the membrane gene chip method for RFP displayed the sensitivity 83.78%（31/37），specificity 94.06%（95/101），concordance 91.97%（126/137），the value of Kappa was 0.79，P＜0.05；INH displayed the sensitivity 80.65%（25/31），specificity 94.29%（99/105），concordance 90.51%（124/137），the value of Kappa was 0.73，P＜0.05；the total concordances were 91.24% （250/274）for the two drugs.Conclusion The membrane gene chip susceptibility results and absolute concentration method susceptibility results are highly consistent，which is adapted for extensive application in clinical treatment，as it allows fast and accuracy detection of the resistance to RFP and INH in Mtb clinical isolates.

Mycobacterium tuberculosis； Microbial sensitivity tests； Rifampin； Isoniazid； Phenotype；Genotype； Oligonucleotide array sequence analysis

2012-10-23）

（本文編輯：張曉進(jìn)）

518112廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（劉厚明、陳建波、肖顏玉、吳馳、葉飛娣、蔡舒豪、單萬(wàn)水）；結(jié)核病重點(diǎn)專科（鄧群益）；深圳華大基因研究院（趙艷敏）

劉厚明，Email：eric120@126.com