馬鈴薯種薯脫毒苗快速繁殖技術及污染防范措施

徐曉麗 李方華

（甘肅省酒泉職業技術學院生物工程系 735000）

馬鈴薯是我國重要的糧菜兼用作物，在我國分布廣泛，但生產水平卻相對較低，平均667m2產量不足1000kg，僅為發達國家平均667m2產量2500kg的1/3。影響產量的一個重要因素是馬鈴薯病毒，據了解，馬鈴薯可感染30種病毒。由于生產上是應用無性繁殖，經過多年留種種植后，體內病毒的累積使品種植株逐年變小，葉片皺縮卷曲，葉色濃淡不均，莖稈矮小細弱，塊莖變形龜裂，產量逐年下降，對生產造成嚴重危害。由于馬鈴薯育種體系尚不健全，農民自留種現象普遍，生產上大約80%以上馬鈴薯感染病毒。目前，采用馬鈴薯莖尖分生組織培養是解決馬鈴薯種性退化最有效的方法之一，這一技術具有周期短、效率高、能與組織培養快速繁殖相結合等特點，在馬鈴薯生產上普遍應用。

1 脫毒苗的快速繁殖

1.1 培養基制備

冬季采用MS加赤霉素 （0.25mg/L）加奈乙酸（0.01mg/L）加 6-芐基氨基嘌呤（0.5mg/L）加泛酸鈣（2g/L）加白糖3%加瓊脂0.7%，用1moL/LHCI或1moL/L NaOH調節pH值至5.8～6.0（夏季6-芐基氨基嘌呤的量減至0.1mg/L）。

1.2 滅菌

配好的培養基按每瓶25～30mL分裝于培養瓶中，用透氣薄膜封口，旋上瓶蓋，置于121℃、壓力114g/cm的容器中高壓蒸汽滅菌20min，并置于無菌室內待用。

1.3 無菌接種

在無菌超凈工作臺上，用鑷子夾出經病毒檢測合格的試管小植株，按節切段，每段帶1片小葉，然后扦插到經滅菌后的培養基中，每瓶扦插8～12節莖段。接種完畢后，瓶口置于火焰上轉動灼燒消毒，蓋上封口膜，用橡膠圈扎緊，標記上品種名稱和接種日期。

1.4 無毒苗培養

在溫度24～26℃、日照時間12～14h/d、光照度2000～2500Lx條件下培養，待小苗長至10cm左右時，可進行下一輪快繁轉接。

2 馬鈴薯莖尖脫毒培養過程中常見的污染問題

2.1 真菌污染

（1）培養基表面存在大量真菌污染：培養瓶瓶口封得不嚴或培養基存放環境真菌孢子濃度過大。（2）培養基內部存在大量真菌污染：母液儲備液被污染。（3）接種室內真菌孢子濃度過大或超凈工作臺的濾網不干凈：種后培養基表面存在真菌污染而且位置不定。（4）接種到培養基以后，在培養過程中發現外植體周圍出現真菌污染：外植體材料本身帶有菌。（5）培養基中發現污染的真菌是零星地分散在培養基中：人為因素造成的，如培養基和接種器具滅菌不徹底、超凈工作臺長時間不更換濾膜、操作不規范等。

2.2 外植體滅菌不徹底

在室外采集回來的材料，由于生長環境不干凈帶有很多雜菌，如果滅菌處理方法不當，導致滅菌不徹底，在接種培養2～3d后外植體周圍長滿細菌或真菌，或者兩種菌都有。這樣不但得不到預想中的結果，同時還會因為帶菌而影響培養室內的其他培養材料，造成交叉感染。

3 防范措施

3.1 消滅污染源

應定期清理消毒接種室和培養室，保持環境高度清潔，保證所用容器潔凈，接種室要經常用紫外線燈消毒滅菌，對已經被真菌污染的材料要經過高壓滅菌后扔掉，即使僅形成菌絲也應處理后扔掉。遇到內生菌污染可通過在培養基中添加一些抑菌劑或抗生素如青霉素、鏈霉素等來防止和減少內生菌的污染。在馬鈴薯核心種苗的擴繁接種過程中，特別是在轉繼代培養過程中，對所要轉接的馬鈴薯材料一定要在燈光下仔細觀察，確認材料無污染。

3.2 用正確的滅菌方法進行滅菌

對馬鈴薯基礎材料或誘導所得的芽，要先在水龍頭下沖洗干凈，同時拿柔軟的毛刷輕刷表面，最后在超凈工作臺上進行滅菌處理，一般可用10%次氯酸鈉溶液或0.1%升汞溶液進行滅菌。在植物組織培養過程中采用復合滅菌劑處理比使用單一滅菌劑處理滅菌效果更好。因此，在馬鈴薯組織培養過程中，為了增強滅菌效果，可采用混合消毒液或進行多次消毒，即用10%次氯酸鈉溶液滅菌處理2～3min，再用0.1%升汞溶液滅菌處理2～3min，這樣可取得很好的滅菌效果。工作人員在進行接種前要換工作服并帶口罩，并用75%酒精仔細擦手，方可進行下一步工作。同時，工作人員在接種過程中要嚴格按照無菌操作要求進行材料轉接，盡量少走動、不說話，以減少空氣震動和流動，減少污染。

3.3 嚴格接種后的管理

在材料的培養階段，應定期清理消毒培養室，保持培養室內空氣潔凈。定期用甲醛溶液、米醋或臭氧機熏蒸培養室，非工作人員應盡量少進入培養室內。一旦發現污染要及時處理，若為真菌污染，必須對污染的苗用高壓鍋滅菌后銷毀；若為細菌污染，而且被污染的材料是比較稀少且珍貴的，可以對所污染的材料進行挽救。具體做法：將被污染的整瓶材料拿出培養室，用酒精棉蓋住污染處，剪下植株頂部再次進行滅菌處理后轉接到干凈的培養基中。

馬鈴薯脫毒效率直接影響到馬鈴薯原原種的質量，如果采取合適的手段提高脫毒效果，馬鈴薯原原種的質量會明顯提高，所以莖尖培養脫毒育種是一種很有潛力的方法。