痰與其他下呼吸道標本的細菌學檢查的探討

熊淑芹 孫 靜 李秋苓

（山東省平陰縣疾病預防控制中心 山東 平陰 250400）

痰培養(yǎng)主要針對下呼吸道感染病原菌的調查，如細菌性肺炎肺結核、慢性吃氣管炎、支氣管擴張癥、肺膿腫、深部霉菌性肺部感染或肺炎支原體引起的感染等。

如分離到結核分枝桿菌、肺炎支原體或深部霉菌，則可確定為該菌與感染有關，如如分離到金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌等則要小心判斷，因為他們亦可能是上呼吸道常在菌。細菌性肺炎可能分離到的細菌菌種有：金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌科細菌；肺結核可能分離到的細菌：結核分枝桿菌、鳥—胞內分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分支桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌。

1 標本采集

1.1 采集標本均應在用藥前，一般以晨痰為好，刷牙，漱口，以除去口腔內大部分雜菌，患者用力自肺部深處咳出的分泌物，吐入無菌容器內，一小時內送檢。

1.2 檢查結核分枝桿菌者，清晨采集得當。如患者咳痰較少，則應采集24小時痰液，結核培養(yǎng)者應連續(xù)三天采集三次晨痰。

1.3 痰培養(yǎng)亦可用氣管穿刺抽取標本，用14號針頭經環(huán)狀與甲狀軟骨膜小心穿刺。

1.4 支氣管分泌物，應有專科醫(yī)師用支氣管鏡雙層套刷直接采集肺部的感染物。雙層導管可保護采集刷不受口腔正常菌的污染，細菌菌落計數法評價標本的細菌量，一般以103CFU／ml為臨界值。菌落計數方法：取標本約0.1 ml直接插入1.0 ml無菌的林格乳酸鹽溶液，再用接種環(huán)取約0.01 ml置培養(yǎng)基，CO2環(huán)境培養(yǎng)過夜后作細菌菌落計數。當平板上生長菌落大于10個時，表示培養(yǎng)陽性有意義。

1.5 支氣管肺胞沖洗液采集方法，亦用支氣管鏡雙層套刷。須灌入生理鹽水，使之達到支氣管、肺泡、再收回，重復數次。目的是將肺泡內分泌物洗出來，標本應用同時作涂片檢查，鱗狀上皮細泡數目≤1%時，表示未受到口腔分泌物污染。菌落計數≥105CFU／ml才具有診斷意義。此法診斷細菌性肺炎的敏感度達100%、特異性亦達100%。厭氧培養(yǎng)，診斷厭氧菌引起的肺膿瘍。

2 肉眼觀察

觀察痰液的顏變、粘度、有無血絲、濃，如痰呈水樣，明顯是唾液，應拒收。如有顆粒存在，則應注意可能與放線菌及奴卡菌屬有關。

3 革蘭氏染色圖片檢查

選擇呈血色或銹色的膿樣標本作涂片革蘭氏染色鏡檢。

3.1 如診斷為肺炎或標本來自重癥監(jiān)護病房，應在2小時內作出圖片的初步報告。

3.2 一般病人的標本可在當日作出初步報告。

3.3 涂片觀察應細菌的染色、形態(tài)、排列，以及真菌或霉菌的狍子或菌絲。

3.3.1 如發(fā)現許多具有莢膜、矛頭狀排列的革蘭氏陽性雙球菌（有時呈單個、短鏈狀），可能是肺炎鏈球菌，作再作莢膜染色或莢膜腫脹反應。

3.3.2 如發(fā)現許多革蘭氏陽性球菌成簇狀排列，可能是金黃色葡萄球菌。

3.3.3 如發(fā)現許多短而粗的、具有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，可能是肺炎克雷伯球菌。

3.3.4 如發(fā)現革蘭氏陽性分枝桿菌，應懷疑為放線菌或奴卡菌，如肉眼見到硫磺顆粒，則可能性更大，應作抗酸染色，并接種專用培養(yǎng)基。

3.3.5 如發(fā)現革蘭氏陽性的酵母菌或其他霉菌，應接種培養(yǎng)基進行分離。

3.4 革蘭氏染色涂片的結果僅為假設性診斷，快速做出初步報告，并以培養(yǎng)方法證實。

3.5 痰標本接種前還應作白細胞和上皮細胞的檢查，用革蘭氏染色涂片以低倍鏡觀察并計數中性粒細胞及鱗狀上皮細胞，當鱗狀上皮細胞數＞＜25／LPF時應重新送標本。

4 痰標本接種處理

4.1 漂洗法將膿樣痰倒入盛有生理鹽水及玻璃珠的試管中，充分振搖，然后用接種壞接種標本。

4.2 痰溶劑處理法

4.3 消化—去污處理法

5 接種

5.1 按《微生物學手冊》要求接種相應的培養(yǎng)基

5.2 常規(guī)的痰培養(yǎng)基

5.2.1 一個雙盤平板：一半是苯乙醇瓊脂（內含粘菌素和萘啶酸），另一半是EMB或MAC瓊脂。

5.2.2 一個血平板：并貼0.04單位的桿菌肽紙片，如懷疑肺炎球菌時，可再貼5ug／片奧本托欣紙片。

5.2.3 一個巧克力平板。

5.2.4 每個平板均按分段劃線法，將標本中的細菌分離出來。5.2.5 孵育在35℃5%CO2環(huán)境中。

6 鑒定及報告

6.1 第二天觀察各種平板，并記錄細菌生長的數量及菌落形態(tài)。

6.2 每一種生長菌以多量、中量、少量和極少量表示之。（第一區(qū)＞10個，第二區(qū)＜5個為少量；第一區(qū)＞10個，第二區(qū)＞5個為中量；第一區(qū)＞10個，第二區(qū)＞5個，第三區(qū)＞5個為多量）。

6.3 作涂片革蘭氏染色鏡檢。

6.4 具有金黃色葡萄球菌、腸桿菌科細菌、或綠膿假單胞細菌等快速生長菌，可立即做快速藥敏實驗。

6.5 按需要做生化試驗，亦鑒定細菌。

6.6 有可能的話第二天就可發(fā)出最后報告。如疑金黃色葡萄球菌—做血漿凝固酶實驗，如疑銅綠假單跑菌—氧化酶實驗，如疑大腸埃希氏菌—靛基質試驗，肺炎鏈球菌—膽汁溶菌、奧本托欣實驗。

6.7 第三天可報告常規(guī)痰培養(yǎng)的結果 寫出菌名并標出生長的菌量、以數量多寡排列。例如：主要生長菌為 金黃色葡萄球菌，多量；流感嗜血桿菌，多量；奈瑟菌屬細菌，少量。報告多量生長菌的藥敏結果。

6.8 只有當培養(yǎng)生長菌數量為多量時到中量時才有可能為致病菌。

6.9 痰培養(yǎng)可能有1～3種報告，臨床醫(yī)師可依據臨床癥狀及涂片結果判斷作出何種為真正的致病菌。例如肺炎鏈球菌生長速度較慢，可能被生長速度快的細菌所掩蓋，培養(yǎng)結果僅供參考，很可能被忽略掉，如先觀看直接涂片，可以反映標本中各種細菌的真實數量。

7 注意事項

痰培養(yǎng)經常會有錯誤發(fā)生、至少能得到很準確的結果，其原因有：

7.1 收集標本的人員不明了必須采集新鮮、深部咳出的痰液。

7.2 沒有迅速將標本送到實驗室，檢驗人員沒有立即處理標本。

7.3 痰標本受到口咽處正常菌群的污染。

7.4 難以決定所分離到的菌種何者確實與肺部感染有關，因痰培養(yǎng)很少得到純培養(yǎng)。曾經有人報告肺炎鏈球菌菌血癥的患者痰標本中有45%培養(yǎng)不出現肺炎鏈球菌。

7.5 痰標本不能作厭氧培養(yǎng)。

7.6 痰液標本作結核分枝桿菌培養(yǎng) 作結核分枝桿菌檢查的實驗室應具備生物安全柜，操作室的消毒設施必須安全，沾有分枝桿菌的接種環(huán)不能直接在火焰上消毒，任何廢棄物必須滅菌后棄之，任何時候應防止感染自己或傳染他人。