白藜蘆醇調控miR-25對高糖誘導成骨細胞增殖和凋亡的作用機制

劉軍 任昆明 王志強 朱溫帥 孫學成

(濰坊市人民醫院創傷骨科，山東 濰坊 261021)

糖尿病性骨質疏松是糖尿病慢性并發癥之一，隨著糖尿病進程進展表現為骨量減少、骨骼微結構破壞、骨骼脆性增加，易出現骨折。白藜蘆醇除具有抗腫瘤、清除自由基、抗感染、心臟和血管保護等多種有益作用，白藜蘆醇還具有較強的骨保護作用〔1,2〕。然而，白藜蘆醇在糖尿病性骨質疏松中的作用機制并未闡明。研究顯示在成骨細胞分化過程中miR-25表達上調，miR-25過表達顯著提高細胞活力和遷移能力〔3〕。大黃素通過上調miR-25抑制低氧誘導的PC-12細胞損傷〔4〕。高糖刺激可引起成骨細胞增殖分化能力減弱和凋亡增加，其誘導的成骨細胞是研究糖尿病性骨質疏松的常用細胞模型〔5,6〕。本研究通過觀察白藜蘆醇對高糖條件下成骨細胞MC3T3-E1增殖、凋亡及miR-25表達的影響，探索其保護作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 小鼠MC3T3-E1細胞(美國ATCC)；α-MEM低糖型培養基、胎牛血清、青鏈霉素溶液(美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞增殖分析檢測試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI，北京索萊寶生物科技有限公司)；TRIzol試劑、放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；兔抗細胞周期素(cyclin)D1抗體、兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)-3抗體、兔源磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)抗體、兔源p-p65抗體、兔抗β-actin及山羊抗兔IgG(美國Abcam公司)。

1.2細胞培養和模型構建 成骨細胞MC3T3-E1采用α-MEM低糖型培養基(含10%胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗)進行培養，常規換液傳代，取對數期細胞進行實驗。采用葡萄糖濃度為5.5、25.0 mmol/L的α-MEM培養液培養細胞7 d，依次計為正常對照(NC)組和高糖(HG)組。

1.3MTT法檢測細胞活力 將MC3T3-E1細胞按照5×103個/孔接種到96孔板并分為NC組、HG組、HG+20 μmol/L白藜蘆醇組(在高糖誘導基礎上給予終濃度為20 μmol/L白藜蘆醇培養48 h)、HG+40 μmol/L白藜蘆醇組(在高糖誘導基礎上給予終濃度為40 μmol/L白藜蘆醇培養48 h)、HG+80 μmol/L白藜蘆醇組(在高糖誘導基礎上給予終濃度為80 μmol/L白藜蘆醇培養48 h)，各組細胞進行相應處理后，每孔加入20 μl的MTT，培養箱繼續孵育4 h，棄去上清液，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)振蕩溶解10 min，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值。確定用藥濃度。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集NC組、HG組、HG+40 μmol/L白藜蘆醇組MC3T3-E1細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入適量的1×結合緩沖液調整細胞濃度為1×105個/ml細胞懸液。取100 μl細胞懸液加入流式管，分別加入5 μl的Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min，補加1×結合緩沖液至500 μl，1 h內上機檢測細胞凋亡情況。

1.5RT-qPCR檢測miR-25的表達水平 收集NC組、HG組、HG+40 μmol/L白藜蘆醇組MC3T3-E1細胞，PBS洗滌細胞2次，按照TRIzol試劑盒說明書提取各組細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，利用實時定量PCR儀進行擴增。引物序列如下：miR-25上游引物5′-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3′，下游5′-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內源性參照，根據2-ΔΔCt法計算miR-25的表達水平。

1.6Western印跡檢測Cleaved-caspase-3的表達水平 收集NC組、HG組、HG+40 μmol/L白藜蘆醇組MC3T3-E1細胞，RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度。按照蛋白變性、配膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳、常規轉膜、膜的封閉步驟進行。隨后采用稀釋的Ⅰ抗溶液在室溫條件下孵育膜2 h，洗膜后，采用稀釋的Ⅱ抗溶液在室溫條件下孵育膜1 h，洗膜后，采用化學發光顯色劑于暗室內顯色。以β-actin為內參，采用ImageJ進行分析，以目標蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。

1.7高表達miR-25對MC3T3-E1細胞增殖和凋亡的影響 將MC3T3-E1細胞接種到96孔板并分為NC組、HG組、HG+miR-con組(轉染miR-con后進行高糖刺激)、HG+miR-25組(轉染miR-25 mimics后進行高糖刺激)。按照上述1.3方法步驟分別檢測細胞的存活和凋亡情況及cyclinD1、cleaved-caspase-3和miR-25表達水平。

1.8白藜蘆醇調控miR-25對高糖誘導的成骨細胞增殖和凋亡的影響 為證實白藜蘆醇是通過上調miR-25進而影響高糖誘導的成骨細胞增殖和凋亡，將MC3T3-E1細胞分為白藜蘆醇+HG+anti-miR-con組(轉染anti-miR-con至MC3T3-E1細胞，隨后進行高糖刺激和40 μmol/L白藜蘆醇干預)、白藜蘆醇+HG+anti-miR-25組(轉染anti-miR-25至MC3T3-E1細胞，隨后進行高糖刺激和40 μmol/L白藜蘆醇干預)。按照上述1.3方法步驟分別檢測MC3T3-E1細胞存活、凋亡及cyclinD1、cleaved-caspase-3表達情況。細胞轉染嚴格按照LipofectamineTM2000使用說明進行轉染。

1.9白藜蘆醇對高糖誘導的成骨細胞NF-κB信號通路的影響 收集HG組、白藜蘆醇+HG組、白藜蘆醇+HG+anti-miR-con組、白藜蘆醇+HG+anti-miR-25組MC3T3-E1細胞，按照上述Western印跡檢測步驟測定核因子(NF)-κB信號通路蛋白p-p65和(p-IκBα)的表達水平。本研究所有實驗設置3個復孔或平行實驗，重復3次，取平均值。

1.10統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗，方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度白藜蘆醇對高糖誘導的成骨細胞增殖的影響 與NC組〔(100.11±10.05)%〕比較，HG組MC3T3-E1細胞的存活率〔(36.56±3.66)%〕顯著降低；與HG組比較，HG+白藜蘆醇組MC3T3-E1細胞的存活率顯著升高〔20 μmol/L白藜蘆醇(52.35±5.25)%、40 μmol/L白藜蘆醇(88.36±8.84)%、80 μmol/L白藜蘆醇(90.21±9.03)%，P<0.05〕。隨著白藜蘆醇濃度的逐漸增加，細胞存活率顯著升高，呈一定劑量依賴關系。選取40 μmol/L的白藜蘆醇濃度進行后續研究。

2.240 μmol/L白藜蘆醇對高糖誘導的成骨細胞凋亡的影響 與NC組比較，HG組MC3T3-E1細胞Cleaved-caspase-3蛋白表達水平、細胞凋亡率均顯著增加(均P<0.05)；與HG組比較，HG+40 μmol/L白藜蘆醇組MC3T3-E1細胞Cleaved-caspase-3蛋白表達水平、細胞凋亡率均顯著降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡

1～3：NC組，HG組，HG+40 μmol/L白藜蘆醇組圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表1 40 μmol/L白藜蘆醇對高糖誘導的成骨細胞凋亡的影響

2.340 μmol/L白蘆藜醇對miR-25表達水平的影響 與NC組(1.00±0.11)比較，HG組MC3T3-E1細胞miR-25表達水平(0.36±0.04)顯著降低；與HG組比較，HG+40 μmol/L白藜蘆醇組MC3T3-E1細胞miR-25的表達水平顯著升高(0.89±0.09,P<0.05)。

2.4高表達miR-25對MC3T3-E1細胞增殖和凋亡的影響 與NC組比較，HG組MC3T3-E1細胞miR-25、CyclinD1蛋白表達、細胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)；與HG+miR-con組比較，HG+miR-25組MC3T3-E1細胞miR-25、CyclinD1蛋白表達、細胞存活率顯著升高，Cleaved-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見圖3和表2。

1～4:NC組,HG組,HG+miR-con組,HG+miR-25組圖3 Western印跡檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表2 高表達miR-25對MC3T3-E1細胞增殖和凋亡的影響

2.5低表達miR-25可以逆轉白藜蘆醇對高糖誘導的成骨細胞增殖和凋亡的影響 與白藜蘆醇+HG+anti-miR-con組比較，白藜蘆醇+HG+anti-miR-25組MC3T3-E1細胞miR-25、CyclinD1蛋白表達、細胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高(均P<0.001)。見表3、圖4。

表3 低表達miR-25可以逆轉白藜蘆醇對高糖誘導的成骨細胞增殖和凋亡的影響

1，2：白藜蘆醇+HG+anti-miR-con組,白藜蘆醇+HG+anti-miR-25組圖4 Western印跡檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

2.6NF-κB信號通路的蛋白表達 與HG組比較，白藜蘆醇+HG組p-p65、p-IκBα蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)；與白藜蘆醇+HG+anti-miR-con組比較，白藜蘆醇+HG+anti-miR-25組p-p65、p-IκBα蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。見圖5和表4。

1～4：HG組,白藜蘆醇+HG組，白藜蘆醇+HG+anti-miR-con組,白藜蘆醇+HG+anti-miR-25組圖5 Western印跡檢測p-p65、p-IκBα蛋白的表達

表4 Western印跡檢測NF-κB信號通路蛋白的表達

3 討 論

成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，在整個骨形成過程中，成骨細胞的增殖減弱和凋亡增加是骨量減少的重要原因之一。白藜蘆醇具有較強的骨保護作用。Durbin等〔7〕研究表明白藜蘆醇的攝入可防止大鼠后肢的骨質流失；蔡德等〔8〕研究發現白藜蘆醇還可促進人骨髓基質細胞的增殖和成骨分化；白藜蘆醇還可提高成骨細胞活力，改善糖尿病患者鈦合金內植物的骨整合效果〔9〕。本研究表明白藜蘆醇可提高成骨細胞活力，對高糖誘導的成骨細胞凋亡具有顯著的抑制作用。

miR-25是一種與骨修復密切相關的微小RNA，Lang等〔10〕研究顯示高表達miR-25可促進骨折端成骨細胞分化，促進骨痂形成及骨折愈合，增加骨最大負荷、斷裂能量和剛度。Li等〔3〕研究發現miR-25通過上調Rac1表達激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路促進成骨細胞的分化和遷移。此外，楊麗等〔11〕研究指出miR-25通過靶向TWIST1調控骨細胞的礦化。本研究顯示高糖刺激后MC3T3-E1細胞miR-25的表達水平顯著降低，而一定濃度的白藜蘆醇干預可提高高糖刺激下miR-25表達水平。進一步研究顯示過表達miR-25可提高MC3T3-E1細胞促增殖蛋白CyclinD1的表達水平，降低促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達，促進細胞存活，抑制細胞凋亡，減輕高糖刺激對MC3T3-E1細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，與白藜蘆醇對高糖誘導的MC3T3-E1細胞保護作用一致。此外，低表達miR-25可逆轉白藜蘆醇對高糖誘導的MC3T3-E1細胞增殖和凋亡的影響。以上研究表明白藜蘆醇通過上調miR-25表達對高糖誘導的成骨細胞發揮保護作用。

NF-κB作為一種重要的細胞內信號通路，在骨重塑過程中發揮重要作用〔12〕。鹿茸多肽通過抑制NF-κB信號通路增強成骨細胞分化抑制破骨細胞形成對類風濕關節炎和骨質疏松等骨溶解性疾病具有潛在的治療作用〔13〕。薯蕷皂苷通過抑制NF-κB信號通路對成骨細胞的增殖和分化具有一定的促進作用〔14〕。此外，白藜蘆醇通過下調NF-κB信號通路對骨關節炎軟骨病變具有保護作用〔15〕。本研究提示白藜蘆醇通過調控miR-25抑制NF-κB信號通路對高糖誘導的成骨細胞凋亡具有保護作用。