羅氏電化學發光檢測系統乙型肝炎表面抗原定量檢測方法學評價及性能驗證

吳文清，黃志基（復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海 200040）

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）檢測的臨床應用極為廣泛。隨著檢測技術的發展，HBsAg的定量檢測也以逐步應用于臨床，對判斷乙型肝炎病毒（HBV）感染患者免疫應答狀態、抗病毒療效評價及制訂治療方案等方面有著重要意義［1］。早期用于HBsAg定量檢測的方法僅能檢測原倍血清，且檢測線性范圍很小，檢測上限一般為130～250IU／mL，使其臨床應用嚴重受限。羅氏公司Elecsys MODULAR ANALYTICS E－170電化學免疫分析系統（簡稱E－170分析系統）可用于HBsAg定量檢測，且檢測上限可達52 000IU／mL。筆者根據美國病理學家協會（CAP）和ISO15189對實驗室質量的管理要求和實驗室認可的要求［2－3］，對E－170分析系統進行了 HBsAg檢測方法學評價和性能驗證，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床標本來源 收集高、低濃度水平新鮮血清標本用于批內重復性測定和批間重復性測定。

1.2 儀器與試劑 羅氏公司E－170分析系統及配套HBsAg定量檢測試劑（批號165611）、HBsAg定標液（批號165611）和其他試劑。以自制混合血清（高值6 157.77IU／mL，低值1 580.88IU／mL）作為質控品。

1.3 方法

1.3.1 標本檢測每日校準、定標后進行高、低值質控品檢測，共20d，計算均值和標準差，確認本系統質控范圍。每次檢測標本前先進行質控品檢測，確認在控后進行標本檢測。

1.3.2 不精密度評價 （1）批內不精密度評價：選擇高濃度、低濃度混合血清1份，連續檢測20次，計算標準差和批內變異系數，評價批內不精密度。（2）批間不精密度評價：選擇高濃度混合血清1份，分裝為20份，－30℃保存，每天檢測1份，連續檢測20d，計算標準差和批間變異系數，評價批間不精密度。

1.3.3 分析測量范圍（AMR）驗證 按EP6－P2文件要求［4］，取低濃度（22.075IU／mL）和高濃度（48 158.25IU／mL）血清各1份，按體積比3∶1、1∶1、1∶3混合，制備混合血清標本3份，連同未混合的血清標本共5份，每份標本檢測4次，計算均值，以理論值和測試均值作回歸分析，計算回歸方程，按α＝1.00±0.05、r≥0.97為標準進行AMR驗證。

1.3.4 可報告低限值（LoQ）驗證 選擇HBsAg濃度接近1∶400稀釋檢測低限值（20IU／mL）的血清樣本1份，每天檢測1次，連續檢測12d，計算均值、標準差和變異系數，以變異系數不超過20%為標準，驗證LoQ。

1.3.5 儀器自動稀釋正確度驗證 選擇11份HBsAg濃度即可用原倍血清檢測，又可自動稀釋檢測的標本，分別檢測原倍血清和1∶400自動稀釋血清，計算其偏差，以偏差小于20%為標準，驗證自動稀釋正確度。

2 結 果

2.1 不精密度評價 高濃度標本（26 222.35IU／mL）批內不精密度評價的標準差為520.76IU／mL，變異系數為1.99%；低濃度標本（40.69IU／mL）標準差為0.91IU／mL，變異系數為2.23%。高濃度標本（27 005.80IU／mL）批間不精密度評價的標準差為853.59IU／mL，變異系數為3.16%；低濃度標本（42.47IU／mL）標準差為1.71IU／mL，變異系數為4.03%。

2.2 AMR驗證 5份待測標本理論值由高到低依次為48 158.25、36 124.21、24 090.16、12 056.12、22.075IU／mL，實測值均值由高到低依次為48 158.25、34 527.00、22 511.00、10 805.75、22.075IU／mL，經回歸分析計算回歸方程為Y＝0.997 1X－815.92，r2＝0.998 1，符合判斷標準的要求，故本系統檢測HBsAg的AMR為22.075～48 158.25IU／mL。

2.3 LoQ驗證 12次檢測結果均值為24.905IU／mL，標準差為0.934IU／mL、變異系數為3.751%，符合判斷標準的要求，故可認為本系統檢測HBsAg的LoQ為24.905IU／mL。

2.4 儀器自動稀釋正確度評價 11份標本原倍和1∶400稀釋液檢測結果均值分別為77.8、83.3IU／mL，偏差值的均值為7.06%，符合判斷標準的要求，故本系統自動稀釋檢測HBsAg具有較高正確度。

3 討 論

E－170分析系統為封閉檢測系統，所有試劑和耗品均為羅氏公司產品，說明書提供的所有參數均為廠家在國外的最佳條件下進行試驗所獲得的，而每個實驗室的外部條件與最佳條件存在較大差異，包括水質、電壓穩定性、環境溫濕度、人員操作習慣等均有所不同。因此，每個實驗室都必須對檢測系統建立符合自身條件的方法學參數。此外，說明書只提供了原倍血清的方法學參數，即0.05～130IU／mL之間檢測結果的驗證，而需要進行HBsAg定量檢測以監控療效患者，其血清HBsAg濃度往往達到該濃度范圍的幾十至幾百倍，即需進行儀器1∶400稀釋。因此，本次方法學評價主要基于1∶400稀釋度，評價結果為：HBsAg定量檢測批內精密度（以變異系數表示）分別為2.23%和1.99%，批間精密度（以變異系數表示）分別為4.03%和3.16%，均與說明書提供的參數基本一致，符合美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）文件EP5－A，完全能夠滿足臨床診斷的要求［4－5］。

AMR驗證的目的是驗證檢測系統的最高檢測值和高低檢測值之間是否呈線性關系，實驗室應為每個系統建立各自的線性參數，不應直接引用廠家提供的線性范圍［5－6］。本次驗證HBsAg定量檢測的最高檢測值為48 158.25IU／mL，且高低檢測值呈線性關系。

目前多是實驗室將說明書提供的分析靈敏度作為檢測系統的最低檢測限，這不僅存在著上述的系統差異，更可能存在著引用錯誤。按最新的觀點，功能靈敏度才是檢測系統的最低檢測限，但大部分廠家未提供功能靈敏度，即使提供，每個實驗室也應建立自己的靈敏度或對其進行驗證。本次驗證結果表明，E－170分析系統HBsAg定量檢測的功能靈敏度為24.91 IU／mL。

當臨床標本的檢測值超過線性范圍時，臨床一般要求報告確切值。因此，對于超過線性范圍的標本，實驗室一般會進行稀釋后檢測。但是否存在稀釋效應，應通過試驗來證實。臨床可報告范圍評價就是了解檢測項目的最大可稀釋度［7］。本次驗證結果顯示，以1∶400稀釋時，原倍血清和稀釋血清檢測結果的整體偏差為7.02%，與理論值基本相符。因此，可認為廠商提供的E－170分析系統HBsAg定量檢測最高1∶400稀釋度可以使用。

綜上所述，E－170分析系統定量檢測HBsAg的性能符合CAP、IOS15189實驗室認可及臨床的要求；部分性能指標評價結果與廠家提供的參數不完全相同，說明廠家提供的方法學參數不能全部直接引用，各實驗室應建立自己的分析性能指標。

［1］Chan HLY，Wong VWS，Tse AML，et al.Serum hepatitis B surface antigen quantitation can refluent hepatitis B virus in the liver and predict treatment response［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5（10）：1462－1468.

［2］ College of American Pathologists.Clinical immunology checklist［M］.Washington，USA：CAP，2006.

［3］叢玉隆，馮仁豐，陳曉東.臨床實驗室管理學［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2004：72－73，89－102，123－129.

［4］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP5－A Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1999.

［5］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP6－P2Evaluation of linearity of quantitative analytical methods.Proposed guideline－second edition［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1996.

［6］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP9－A Method comparison and bias estimation using patient samples［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1995.

［7］ National Committee of Clinical Laboratory Standard.EP10－A Preliminary evaluation of quantitative clinical laboratory methods［S］.Wayne，PA，USA：NCCLS，1998.