燒酒曲中扣囊復膜酵母的分離及鑒定*

應玲云，伍時華，趙東玲，何啟剛，劉光鵬，黃翠姬，易弋

(廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州，545006)

糯米酒是中國特色的傳統釀造酒，在其釀造過程中酒曲起關鍵作用。傳統酒曲的微生物數量及種類難以控制，造成酒曲質量不穩定。為穩定酒曲質量，人們從酒曲中篩選真菌進行純菌種制曲。酵母菌的主要作用是將還原糖分解為酒精、CO2和一些副產物(如高級醇、酯)［1］，其中一些酵母菌(如扣囊復膜酵母)不僅能產生酒精，還能分泌胞外淀粉酶同化淀粉［2-3］。扣囊復膜酵母可以在各種淀粉基質中存活，在以大米為原料的釀造酒生產過程中起著重要作用［4］。Djien 將扣囊復膜酵母與魯氏淀粉霉(Amylomyces rouxii)制成純菌種固態曲，制造出高質量的印尼發酵食品(tapé ketan)［5］。

本文從燒酒曲中篩選出1 株能在YPS 瓊脂平板上生長的產淀粉酶酵母菌，對其進行形態學、生理生化特征和18S rDNA、ITS 序列分析鑒定，并對此酵母的淀粉酶活力及酒精發酵能力進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料

廣西融水燒酒曲;EX Taq DNA 聚合酶;E. Z. N. A.TMGel Extraction Kit;E. Z. N. A.TMPlasmid Mini Kit I;實驗菌株:YW12(本研究)，Saccharomyces cerevisiae GGFS16(本實驗室保藏)。

1.2 培養基

YPD 培養基(g/L):酵母浸膏10，細菌學蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂20，pH 自然。

YPS 培養基(g/L):酵母浸膏10，細菌學蛋白胨20，可溶性淀粉20，瓊脂20，pH 自然。

產孢培養基(g/L):酵母浸膏1，醋酸鉀10，葡萄糖0.5，pH 自然。

以上培養基不加瓊脂時作液體培養基使用，均在115 ℃下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 菌株的篩選

稱取經研缽研碎的燒酒曲1.0 g，加入到99 mL 帶玻璃珠的生理鹽水(0.85% NaCl，w/v)中，120 r/min 振蕩10 min。對菌懸液進行10 倍系列稀釋，各取10 μL 涂布于YPS 平板，28 ℃倒置培養2 d。挑取菌落直徑最大的菌株(YW12)進行3 次劃線分離，4 ℃保藏備用。

1.4 YW12 的形態學鑒定

1.4.1 菌落及細胞形態觀察

將YW12 接種到YPD 瓊脂平板上，28 ℃倒置培養2 d，觀察其菌落形態;將YW12 接種到YPD 液體培養基中，28 ℃、160 r/min 培養，在0、12、24、36 h 時取樣，用Motic 數碼顯微鏡(DMB5)觀察并拍照。

1.4.2 子囊孢子觀察

菌株的子囊孢子觀察方法見文獻［6］。

1.4.3 假菌絲形態觀察

菌株的假菌絲形態觀察方法見文獻［7］。

1.5 YW12 的生理生化特征鑒定

菌株的生理生化特征鑒定方法見文獻［8］。

1.6 YW12 的分子鑒定

18S rDNA 序列的PCR 擴增采用真菌通用引物，EF4(5’-GGAAGGGGTGTATTTATTAG-3’)，EF3(5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’)［9］，擴增條件為:94 ℃60 s，55 ℃60 s，72 ℃90 s，35 個循環。ITS 區序列的PCR 擴增采用真菌通用引物，ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS4(5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)［10］，擴增條件為:94 ℃60 s，53℃60 s，72 ℃90 s，35 個循環。將擴增產物膠回收、TA 克隆、測序(上海英俊生物技術有限公司)。將序列結果在NCBI 數據庫中進行BLASTN 分析，并通過MEGA 5.0 軟件建立系統進化樹。

1.7 YW12 的淀粉酶活力測定

YW12 的淀粉酶粗酶液制備方法見文獻［11］，利用Yoo 改良法［12］測其粗酶液的淀粉酶活力。淀粉酶活力單位定義為:加入1 mL 酶液在40 ℃、pH 7.0 條件下，5 min 水解1 mg 可溶性淀粉所需的酶量，即為1 個酶活力單位，以U/mL 表示［12］。

1.8 YW12 的酒精發酵能力測定

糯米糖化液的制備方法見文獻［13］，取100 mL 糯米糖化液裝于500 mL 三角瓶，115 ℃滅菌10 min，備用。取1 mL YW12 菌液(OD600=1.6)接種于100 mL糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)和100 mL YPD 液體培養基(含100 g/L 葡萄糖)，28 ℃、120 r/min 分別培養3 d 和4 d，用蒸餾法［14］測其酒精度。

在YW12 的生理生化特征鑒定、淀粉酶活力和酒精發酵能力測定中，S.cerevisiae GGFS16 作為參考菌株。

2 結果與討論

2.1 YW12 的形態學鑒定

2.1.1 菌落形態

YW12 在YPD 平板上28 ℃培養3 d，其菌落呈圓形、白色，同心圓明顯，干燥不透明，表面及邊緣呈菌絲狀，直徑5 ～8 mm(圖1a)。

2.1.2 細胞形態

YW12 在YPD 液體培養基中28 ℃、120 r/min 培養，在0 h、12 h、24 h、36 h 時，其細胞形態如圖1b -1e。YW12 剛接入YPD 液體培養基時，細胞大多是橢圓形單細胞(圖1b);培養12 h 時，細胞多數呈菌絲狀(圖1c);培養24 h 時，有菌絲但主要是單細胞(圖1d);培養36 h 時，細胞大多是單細胞(圖1e)。YW12 在YPD 液體培養基培養36 h 的過程中，其細胞形態呈動態變化。

2.1.3 子囊孢子形態

YW12 在產孢培養基上25 ℃、120 r/min 培養5 d，其子囊呈卵圓形，含有2 個帽形子囊孢子(圖1f 和圖1g)。

2.1.4 假菌絲形態

YW12 在YPD 培養基載片培養3 d，其菌絲沒有橫隔，各細胞間僅以狹小的面積相連，在分隔處縊縮，呈藕節狀(圖1h)，此菌絲為假菌絲。

由YW12 的菌落、細胞、子囊孢子和假菌絲形態鑒定推測YW12 可能是扣囊復膜酵母。

圖1 YW12 的菌落和細胞形態特征Fig.1 The colony and cell morphological characteristics of YW12

2.2 YW12 的生理生化特征鑒定

在糖發酵測試中，YW12 能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，但不能利用乳糖(表1);在同化反應及其它特征測試中，YW12 能同化葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉和肌醇，在37 ℃下能生長，在YPD 瓊脂培養基(含60%葡萄糖)上不能生長(表2)。將YW12 與S. fibuligera 的生理生化特征［15］相比較，初步確認YW12 為扣囊復膜酵母。

表1 菌株YW12 和S.cerevisiaeGGFS16 的糖發酵性能Table 1 The fermentation of different sugars in YW12 and S.cerevisiae GGSF16

表2 菌株YW12 和S.cerevisiae GGFS16 的同化反應及其它特征Table 2 Assimilation reactions and other characteristics of YW12 and S.cerevisiae GGSF16

2.3 YW12 的18S rDNA 序列分析和進化樹構建

酵母菌18S rRNA 存在不同保守程度序列的鑲嵌現象(從高保守區到半保守區到高可變區)，使得18S rDNA 可以用來衡量較遠的親緣關系，作為鑒定到屬的指標［16］。

為進一步確定YW12 的分類地位，通過對其18S rDNA 序列的BLASTN 分析，并調取其相關菌株的18S rDNA 序列，利用MAGE 5.0 軟件的鄰位連接法進行系統進化樹的構建和分析(圖2)。結果表明，YW12 屬于復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)，與Saccharomycopsis fibuligera NRRL Y-2388T聚在一個分支中，相似性為99%。

圖2 YW12 與相關菌株的18S rDNA 系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequence in YW12 and its closest relatives

2.4 YW12 的ITS 區序列分析和進化樹構建

ITS 區介于l8S rDNA 和28S rDNA 之間，并被5.8S rDNA 分為ITS1 和ITS2 兩個區。ITS1 和ITS2是中度保守區域，其保守性基本上表現為種內相對一致，種間差異比較明顯，這一特點使ITS 區適合于屬內種的區分［17］。若兩個菌株整個ITS 區序列相似性大于等于99%，則可認為是同一種［18］。

通過對YW12 的ITS 序列的BLASTN 分析，并調取其相關菌株的ITS 序列，利用MAGE 5.0 軟件的鄰位連接法進行系統進化樹的構建和分析(圖3)。結果表明，YW12 與Saccharomycopsis fibuligera NN2501聚在一個分支中，相似性為99%。結合YW12 的18S rDNA 系統進化樹分析的結果，可以進一步確認YW12 是扣囊復膜酵母。

2.5 YW12 的淀粉酶活力測定

將YW12 接種于YPS 液體培養基中，28 ℃、160 r/min 培養4 d，用Yoo 改良法測其粗酶液的淀粉酶活力，S. cerevisiae GGFS16 為參考菌株。結果表明，YW12 粗酶液的淀粉酶活力為 49.8 U/mL，S. cerevisiae GGFS16 粗酶液的淀粉酶活力為0 U/mL。YW12 能分泌胞外淀粉酶，S. cerevisiae GGFS16 不能分泌胞外淀粉酶，和Naoko 等［11］實驗得出扣囊復膜酵母能分泌胞外淀粉酶，但釀酒酵母不能分泌胞外淀粉酶的結論一致。

圖3 YW12 與相關菌株的ITS 區序列系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the ITS region sequence in YW12 and its closest relatives

2.6 YW12 的酒精發酵能力測定

酵母菌能把還原糖轉化為酒精和CO2，通過測定最終酒精度判定其發酵能力。本研究將YW12 接種于糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)和YPD 液體培養基(含100 g/L 葡萄糖)，28 ℃分別發酵3 d 和4 d，其酒精度(v/v)為5.63% 和1.71%。將S. cerevisiae GGFS16 接種于糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)和YPD 液體培養基(含100 g/L 葡萄糖)，28 ℃分別發酵3 d 和4 d，其酒精度(v/v)為10.33%和4.45%。YW12 在糯米糖化液和YPD 液體培養基中發酵酒精能力比S. cerevisiae GGFS16 低。YW12 的發酵酒精度不高，可能與初葡萄糖濃度偏高有關。發酵液的葡萄糖濃度影響酵母菌生長，低濃度葡萄糖使酵母菌因營養不足而生長緩慢，高濃度葡萄糖抑制其酒精發酵［19］。

圖4 菌株YW12 和GGFS16 發酵酒精度的比較Fig.4 Ethanol fermentation of YW12 and GGFS16

3 結論

本文從燒酒曲中分離出1 株產淀粉酶酵母菌(YW12)，通過形態、生理生化特征及18S rDNA、ITS區序列分析鑒定，確定其為扣囊復膜酵母。YW12 在YPS 液體培養基中培養4 d，其粗酶液的淀粉酶活力為49.8 U/mL。YW12 在糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)中發酵3 d 的酒精度為5.63%(v/v)。YW12既能同化淀粉又能發酵產生酒精，具有用于純菌種釀造糯米酒的潛能，為進一步開展純菌種釀造糯米酒奠定基礎。

［1］ Rojas V，Gil J V，Pi?aga F，et al. Studies on acetate ester production by non-Saccharomyces wine yeasts［J］. International Journal of Food Microbiology，2001，70(3):283 -289.

［2］ Limtong S，Sintara S，Suwanarit P，et al. Yeast diversity in Thai traditional fermentation starter (Loog-pang)［J］.Kasetsart J (Nat Sci)，2002，36:149 -158.

［3］ Hesseltine C W，Kurtzman C P. Yeasts in amylolytic food starters［J］. Anales del Instituto de Biologia，1990(1):1-7.

［4］ Nga B H，Chiu L L，Koh S I，et al. Occurrence of genetic segregation in a putative haploid strain of Endomyces fibuliger met by spontaneous sectoring of protoplast fusants［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology，1994，10(4):465 -471.

［5］ Djien K S. Tape fermentation［J］. Applied Microbiology，1972，23(5):976 -978.

［6］ Adams A，Gottschling D E，Kaiser C A，et al. Methods in yeast genetics:A cold spring harbor laboratory course manual，1997 Edition［M］. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1998:98.

［7］ 路福平，杜連祥. 工業微生物學實驗技術［M］. 中國輕工業出版社，2005:17.

［8］ 王曉紅. 產淀粉酶海洋酵母菌的篩選、鑒定及粗酶性質的研究［D］. 中國海洋大學，2007:23 -25.

［9］ Anderson I C，Campbell C D，Prosser J I. Potential bias of fungal 18S rDNA and internal transcribed spacer polymerase chain reaction primers for estimating fungal biodiversity in soil［J］. Environmental Microbiology，2003，5(1):36-47.

［10］ Jeyaram K，Singh W M，Capece A，et al. Molecular identification of yeast species associated with‘Hamei’—A traditional starter used for rice wine production in Manipur，India［J］. International journal of food microbiology，2008，124(2):115 -125.

［11］ Tsuyoshi N，Fudou R，Yamanaka S，et al. Identification of yeast strains isolated from marcha in Sikkim，a microbial starter for amylolytic fermentation［J］. International journal of food microbiology，2005，99(2):135 -146.

［12］ Su S，Zhang L，Guo L. Screening high efficiency degradation starch and protein strains from potato skins slurry［J］. Modern Applied Science，2011，5(2):235.

［13］ Dung N，Rombouts F M，Nout M. Functionality of selected strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine starters［J］. Food microbiology，2006，23(4):331 -340.

［14］ 傅金泉. 黃酒生產技術［M］. 北京:化學工業出版社，2005:436.

［15］ Barnett J A，Payne R W，Yarrow D. 酵母菌的特征與鑒定手冊［M］. 青島:青島海洋大學出版社，1991:116 -119.

［16］ 許超德，李紹蘭. 核酸分子系統學方法在酵母菌分類中的應用進展［J］.微生物學通報，2004，31(3):126-129.

［17］ Mitchell T G，White T J，Taylor J W. Comparison of 5.8 S ribosomal DNA sequences among the basidiomycetous yeast genera Cystofilobasidium，Filobasidium and Filobasidiella［J］. Medical Mycology，1992，30(3):207 -218.

［18］ Landeweert R，Leeflang P，Kuyper TW，et al. Molecular identification of Ectomycorrhizal Mycelium in soil horizons［J］. Applied and Environmental Microbiology，2003，69(1):327 -333.

［19］ Pereira F B，Guimar?es PMR，Teixeira J A，et al. Selection of Saccharomyces cerevisiae strains for efficient very high gravity bio-ethanol fermentation processes［J］. Biotechnology Letters，2010，32(11):1 655 -1 661.