非發酵型臭豆腐變紅現象的抑制*

高瑩瑩，高海燕，王一凡，吳任綺

(上海大學生命科學學院，上海，200444)

臭豆腐為中國傳統豆制品，因其營養豐富，風味獨特在中國乃至全世界得到廣泛流傳［1］。根據生產工藝不同，臭豆腐可分為發酵型臭豆腐和非發酵型臭豆腐。發酵型臭豆腐在北方比較普遍，又稱臭豆腐乳，以著名的王致和臭豆腐為代表。非發酵型臭豆腐又稱油炸臭豆腐，以長沙火宮殿臭豆腐為代表，儲存期較短，一般為3 ～5 天。

目前，對臭豆腐的研究包括營養價值、生產過程存在的安全問題、風味物質以及臭豆腐鹵中微生物多樣性的研究等［1-10］。受傳統加工工藝和實際生產的制約，非發酵型臭豆腐仍存在許多質量和安全問題。如在銷售存放期間經常會出現表面變紅的現象，炎熱的夏天該現象更為嚴重。一旦變紅，臭豆腐便不能再食用。但迄今為止，針對非發酵型臭豆腐的變紅問題，尚無系統的科學研究，本實驗室前期研究發現，引起此現象的原因與鹵液中的微生物有關。因此，本論文擬從食品安全和實際生產的角度出發，從物理條件、化學防腐劑、植物提取物及生物抑制等幾個角度對該變質現象的控制進行研究，旨在提高非發酵型臭豆腐的儲存期，降低因變紅變質導致的浪費，為提高非發酵型臭豆腐的質量安全提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

變紅臭豆腐、豆坯、鹵(市售)，雙乙酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈣(食用級)，甘草、丁香、大黃(上海藥店)，大蒜(市售)，生防拮抗菌CF-2 和CF -3，由上海大學生命學院食品科學實驗室提供。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;THZ-C 恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠;CHA-213 型雙目生物顯微鏡，日本PLYMPUS 儀器有限公司;756 CRT 紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;RE -3000A 旋轉蒸發儀，上海振捷實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腐敗菌的分離、提純及反接

取臭豆腐變紅表皮打碎過濾，濾液用生理鹽水按10-2～10-7依次稀釋。取100 μL 各濃度的稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨(BP)固體培養基，30 ℃培養24 h。將篩選得到的腐敗菌制成菌懸液，按0.1%的體積分數加入已滅菌的鹵液中，取新鮮豆坯浸鹵4 h，常溫放置12 h 后，觀察其表面腐敗現象是否與生產中變紅豆坯相一致，從而確定該菌株是否為導致非發酵型臭豆腐表皮變紅的腐敗菌株(CR)。

1.3.2 菌懸液的制備

無菌挑取1 環CR菌苔接種于BP 培養基，30 ℃培養24 h，取少量菌苔接種于BP 液體培養基中，30℃培養24 h，取滅菌生理鹽水將其稀釋為106CFU/mL 的菌懸液，備用。

1.3.3 抑制劑的制備

配置濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/kg 的雙乙酸鈉、山梨酸鉀及丙酸鈣溶液，滅菌，4 ℃保存;采用水煎法［11］配置丁香、大黃和甘草提取原液(相當于生藥量1.0 g/mL);以水蒸汽蒸餾法提取大蒜原液(相當于生藥量1.0 g/mL)［12-13］。將提取原液分別稀釋至質量分數為0.20、0.10、0.07、0.05、0.04 g/mL，滅菌，4 ℃保存。

1.3.4 腐敗菌的抑制

物理抑制:取對數期的CR分別于4、16、22、28、37 、55 ℃培養24 h，測定吸光度;調節培養基pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0，NaCl 質量分數分別為2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%、15%、20%，取100 μL 菌懸液接種至不同pH 和不同NaCl 濃度的BP 液體培養基中，30 ℃培養24 h，觀察菌種生長狀況。

化學及植物抑制:采用稀釋混合平板法制備檢測培養基，待培養基(上、下層)均凝固后，將牛津杯垂直放置于培養基表面，杯中加入150 μL 不同濃度的化學防腐劑及植物提取液，30 ℃培養24 h，十字交叉法測定抑菌圈大小。

生物抑制:稀釋混合平板法制備檢測培養基，待培養基(上、下層)均凝固后，取菌落直徑0.7 cm 的培養48 h 的生防拮抗菌CF-2 和CF-3 菌餅置于培養基中央，滅菌的BP 固體培養基菌餅做對照。30℃培養24 h，測定菌餅周圍的抑菌圈大小。

1.3.5 臭豆腐變紅的抑制

篩選在CR抑制中有明顯抑制效果的處理及水平，結合實際生產要求，以豆坯為研究對象，測定常溫保存48 h 后的未變紅率。

未變紅率測定:通過游標卡尺測量實驗各組豆坯的表面積，計算出豆坯暴露于空氣中的總表面積(S1)和未變紅部分的面積(S2)，計算未變紅率:

1.3.6 實際生產中的抑制

根據1.3.5 對臭豆腐變紅的抑制研究結果，采用各種抑制方法并將其互相組合，應用于非發酵型臭豆腐的模擬生產中，與空白組進行對照，記錄臭豆腐出現變紅的時間。

1.3.7 數據分析

重復測定3 次，結果以χ ±SD 表示，采用SPSS(Version16. 0)軟件進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 紅色腐敗菌的分離與反接

實驗中分離得到1 株紅色細菌，將其反接于新鮮豆腐表面，豆坯出現與實際生產中相一致的腐敗變紅現象，從而確定該菌為導致豆坯表皮變紅的腐敗菌CR。該菌只在培養基表面生長，菌落圓形，直徑約2 mm，邊緣平滑，不透明，凸起，顏色呈粉紅色到紅色(紅色的深淺與培養時間成正相關)。

2.2 對腐敗菌CR 的抑制

2.2.1 物理抑制

CR屬好氧菌，無氧狀態下生長受到抑制。由圖1 可知，在22 ～37 ℃條件下培養的CR生長情況良好，低溫(4 ℃)和高溫(55 ℃)條件下，CR的生長受到明顯的抑制。pH 5.0 ～8.0 的范圍內，CR均可以正常生長，抑制效果不顯著。耐鹽性實驗顯示，低鹽(＜2.5%)或者極度高鹽(＞12.5%)的環境中，該菌的生長受到抑制(表1)。

圖1 不同溫度及pH 條件下CR 的生長Fig.1 Growing state of CR under different temperature and pH

表1 CR 在不同的NaCl 濃度下的生長狀況Table 1 Growing state of CR in different sodium chloride concentration

2.2.2 化學防腐劑抑制

根據食品添加劑使用標準［14］，選取豆制品中允許使用的3 種防腐劑及其最大濃度進行實驗，由表2可以看出，3 種防腐劑對CR生長的抑制差異顯著(P ＜0.01)，其中雙乙酸鈉的抑制效果最明顯。CR抑制實驗結果顯示，雙乙酸鈉在0.5 ～2.5 g/kg 對CR菌有較好的抑制效果，且隨濃度增大抑菌效果呈緩慢上升趨勢(圖2)。

表2 不同防腐劑對CR 菌的抑菌活性Table 2 Inhibition effects on CR of different preservatives

圖2 雙乙酸鈉對CR 的抑菌活性Fig.3 Inhibition effects of sodium diacetate on CR

2.2.3 植物提取液抑制

由表2 可知，質量濃度為0.20 g/mL 的4 種植物提取液對CR菌的抑制具有極顯著差異(P ＜0.01)。丁香和大黃提取物抑菌率相對較高，甘草和大蒜對CR菌的生長幾乎沒有抑菌，其中丁香提取物對CR菌的抑菌效果顯著高于其他3 種植物提取物。對不同濃度丁香提取物對CR的抑菌效果進行研究，從圖3 可看出，丁香濃度增加，抑菌率也隨之增加。

表3 不同植物提取液對CR 的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of different plant extract against CR

2.2.4 生物抑制

圖3 不同濃度丁香提取物對CR 的抑制效果Fig.3 Antibacterial activity of different concentration of Flos Caryophlli against CR

生防拮抗菌CF-2 和CF-3 對CR的抑制具有顯著差異(P ＜0.05)。由表4 可見，兩種拮抗菌對CR均有抑制作用，且CF-2 的抑制效果要明顯優于CF-3。

表4 生防菌對CR 的抑制效果Table 4 Inhibition effects of biocontrol bacteria

2.3 對臭豆腐變紅現象的抑制研究

由表5 可知，抽真空包裝處理的豆坯未變紅率達到100%。不同溫度下儲存豆坯，對變紅現象的抑制具顯著差異(P ＜0.01)，4 ℃儲存豆坯未變紅率為100%。不同NaCl 濃度的鹵浸泡后各組之間變紅現象差異顯著(P ＜0.01)，其中，20%和15% NaCl 濃度抑制效果最佳，其次是12.5%和2.5%，與2.2.1 對CR抑制結果相符。由感官檢驗小組進行油炸品嘗，20%、15%、12.5%NaCl 濃度的臭鹵浸泡過的臭豆腐咸度超出普通消費者的接受范圍。結合實際生產鹵液中有益菌對NaCl 生長需求，得出低鹽(≤2.5%)浸泡、低溫儲存或真空包裝均可對其變紅現象進行有效控制，同時不影響其風味。

采用含不同濃度雙乙酸鈉的鹵浸泡過的豆坯變紅現象受到不同程度的抑制，差異顯著(P ＜0.01)。隨雙乙酸鈉濃度增大豆坯未變紅率逐漸降低，與2.2.2 對CR抑制效果一致。結合《食品添加劑使用標準》［14］中豆制品中防腐劑的使用規范，在生產中對臭豆腐中的紅色腐敗現象進行控制時，采用含1.0 g/kg 雙乙酸鈉的鹵液浸泡臭豆腐，可明顯控制變紅現象。

添加不同濃度大黃提取液的鹵浸漬過的豆坯均呈現較深大黃顏色，破壞臭豆腐本身色澤。添加0.07 ～0.20 g/mL 的丁香提取液，臭豆腐變紅比例明顯降低，差異顯著(P ＜0.01)。隨丁香提取液濃度增大未變紅率比例逐漸降低，與2.2.3 對CR抑制試驗結果相一致。結合浸鹵后的豆坯顏色，在生產中添加0.07 g/mL 丁香提取液，可有效降低臭豆腐變紅率，同時不影響豆坯顏色。

向鹵液中接種生防菌CF-2 和CF-3 后進行豆坯的浸鹵，常溫(30 ℃)下放置48 h 內，幾乎沒有豆坯出現變紅，腐敗現象得到有效地控制。

表5 臭豆腐腐敗的抑制Table 5 Inhibition of stinky tofu corruption

2.4 生產中臭豆腐變紅現象的抑制

根據2.2 和2.3 的實驗結果，將對臭豆腐變紅現象抑制較好的幾種方法相結合應用于實際生產中(表6)。由于非發酵型臭豆腐在一定的時間內會出現變酸腐敗，屬短期保存的日銷產品，因此結合生產銷售的實際情況，若臭豆腐在48 h 內不出現變紅即可認為達到保存要求。如表6 所示，抽真空包裝效果最為顯著，不僅不出現變紅，且變酸腐敗的速度也有明顯降低，但生產成本相應的需要提高很多;低溫條件下進行添加或不添加抑制劑均可達到48 h 內不出現變紅的現象;常溫保存，結合1.0 g/kg 的雙乙酸鈉和0.07 g/ml 丁香提取液可達到48 h 內不出現變紅的要求，生產成本相對比低溫或抽真空要低;接種CF-2 或CF-3 的抑制效果也很顯著，實驗后期應繼續對CF-2 和CF-3 的生理生長以及毒理學特性進行研究，方可進行生產中投入使用。

表6 生產中的變紅現象的抑制Table 6 Inhibition of red corruption in production

3 結論

(1)從非發酵型臭豆腐腐敗表皮中分離得到1株紅色細菌，經反接實驗驗證其為引起臭豆腐變紅腐敗的病原菌CR，該菌好氧，需鹽。

(2)抑制實驗顯示，低溫(4 ℃)，真空包裝，1.0 g/kg 雙乙酸鈉、0.07 g/mL 丁香提取液以及本實驗室中保存的生防拮抗菌CF -2 和CF -3，對CR菌的生長均具有良好的抑制效果。

(3)實際生產中在鹵液中同時添加1.0 g/kg 雙乙酸鈉和0.07 g/mL 丁香提取液，可將常溫保存貨架期延長至48 h，低溫(4 ℃)保存貨架期延長至72 h以上，經濟成本較低并且不會影響臭豆腐的品質。

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