木瓜蛋白酶改性對(duì)大豆分離蛋白乳化性能的影響*

慈峰，曹雁平，2，許朵霞，2，王蓓，2

1(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京，100048)2(食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心，北京，100048)

大豆分離蛋白(soy protein isolates，SPI)的蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%以上，在食品加工中經(jīng)常被用作營(yíng)養(yǎng)添加劑［1-4］。大豆蛋白還具有很多的功能特性(如乳化性、膠凝性、發(fā)泡性等)被用來(lái)改善食品的品質(zhì)。但SPI 的乳化性能并不高，限制了它在食品體系中的應(yīng)用，因而需要通過(guò)改性來(lái)提高其乳化性能。目前利用酶改性提高SPI 的乳化性能是人們研究的熱點(diǎn)［5-9］，其中關(guān)于木瓜蛋白酶改性SPI 的報(bào)道較多。現(xiàn)有研究大多是采用基于濁度法測(cè)得的乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)來(lái)表示SPI 的乳化性能;但是，乳狀液的濁度與粒徑之間的關(guān)系非常復(fù)雜，濁度的高低不能準(zhǔn)確反映乳化性能的強(qiáng)弱。本文選擇木瓜蛋白酶對(duì)不同濃度的SPI 溶液針對(duì)提高其乳化性能進(jìn)行研究，通過(guò)測(cè)定常態(tài)與離心狀態(tài)下乳狀液的穩(wěn)定程度來(lái)表示SPI 的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出最佳酶解條件，以期得到高乳化性能的SPI 酶解物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料:大豆分離蛋白(蛋白含量91.0%)，古神生物科技集團(tuán)有限公司;金龍魚(yú)牌大豆色拉油，市售;木瓜蛋白酶(酶活力10 萬(wàn)U/g)Sigma 公司;HCl、NaOH，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器:離心機(jī)，安捷倫國(guó)際股份有限公司;均質(zhì)機(jī)，德國(guó)B. R. T 公司;pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司;分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;恒溫水浴鍋，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;磁力攪拌器，國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案和步驟

1.2.1 酶解SPI 的單因素實(shí)驗(yàn)

取一定質(zhì)量的SPI，用蒸餾水配制成SPI 水溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度(水浴保溫)和pH 分別為50℃和7(木瓜蛋白酶的最適溫度和pH)，然后加入木瓜蛋白酶制劑(酶質(zhì)量分別為SPI 的0.05%、0.15%、0.25%、0.5%、1%、1.5%)，水解后在90℃水浴條件下滅酶15 min，再進(jìn)行乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定。

固定其他條件，分別改變底物(SPI)濃度、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(E/S)、酶解時(shí)間等單一條件，考察SPI 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的變化情況。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

選取SPI 濃度、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時(shí)間3 個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解SPI 條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 酶解SPI 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and the level of SPI orthogonal test

1.3 乳化性能的測(cè)定方法

1.3.1 乳化活性的測(cè)定方法

按照舒展［10］提出的方法進(jìn)行改進(jìn):取50 mL 配好的SPI 溶液，加入25 mL 大豆油，使用均質(zhì)機(jī)19 000 r/min 均質(zhì)10 min。靜置24 h，液體分為上下兩層，上層為穩(wěn)定的乳狀液，下層為析出的水溶液(固形物含量極少，可以忽略)，以形成的乳狀液體積百分比作為乳化活性衡量指標(biāo)。

1.3.2 乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

在照郭興鳳等人［11］提出的方法上加以改進(jìn):將上述乳化樣品于80℃熱水中放置30 min，然后冷卻至室溫，再于2 000 r/min 離心10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與SPI 濃度對(duì)SPI 溶液乳化性能的影響

酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與SPI 濃度對(duì)SPI 溶液乳化活性的影響見(jiàn)圖1。

圖1 E/S 對(duì)SPI 溶液乳化活性的影響Fig.1 Effect of E/S on SPI emulsifying activity

從圖1 中可以看出，沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶解的SPI 的濃度在2% ～5%時(shí)，乳化活性均在46.7%左右，SPI 濃度達(dá)到6% 時(shí)，乳化活性才有了顯著提高，達(dá)到了55.3%。這是因?yàn)椋蜐舛认氯芤旱谋砻鎻埩﹄S乳化劑濃度增加而迅速減小，當(dāng)濃度上升到一定程度時(shí)，每50 ～200 個(gè)蛋白質(zhì)分子彼此靠在一起形成聚集團(tuán)稱(chēng)為膠束，此時(shí)膠束的形成是可逆的，隨著乳化劑濃度的繼續(xù)增加，則可以形成穩(wěn)定膠束［12-15］，從而獲得穩(wěn)定的乳化性能。可見(jiàn)濃度為5% ～6%的SPI 分子可以形成穩(wěn)定的膠束，5%以下的則不能;經(jīng)一定量的木瓜蛋白酶酶解1 h 后，2% ～4%濃度的SPI 溶液的乳化活性幾乎沒(méi)有改變，E/S 達(dá)到0.5%之后，乳化活性則略有下降;只有當(dāng)SPI 濃度達(dá)到5%以上時(shí)，酶解改善乳化活性的作用才體現(xiàn)了出來(lái)，這是因?yàn)?%以下的SPI 溶液中的蛋白質(zhì)膠束是不穩(wěn)定的，改性空間較小。當(dāng)溶液濃度達(dá)到5%后，才開(kāi)始形成了穩(wěn)定的可由木瓜蛋白酶作用的空間。5%與6%的SPI 溶液的乳化活性都是隨著E/S 的增加先升高再降低，在E/S 為0.15%時(shí)最高，5%的SPI 溶液的乳化活性達(dá)到了54.2%，6%的SPI 溶液的乳化活性達(dá)到了67.3%。

酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與SPI 濃度對(duì)SPI 溶液乳化穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 E/S 對(duì)SPI 溶液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of E/S on emulsion stability

從圖2 可以看出，未經(jīng)酶解處理時(shí)，各個(gè)濃度的SPI 溶液的乳化穩(wěn)定性相差不大，2% ～5%的SPI 溶液的乳化穩(wěn)定性在42.3% ～43.5%，6%的SPI 溶液可以達(dá)到44.2%;經(jīng)酶解后，2% ～4%濃度的SPI 溶液的乳化穩(wěn)定性改變不大，當(dāng)E/S 達(dá)到0.5%時(shí)，則開(kāi)始慢慢下降。5%與6%的SPI 溶液的乳化穩(wěn)定性也都是隨著E/S 的增加先增加再減小，在0.15%處最高。5%的SPI 溶液的乳化穩(wěn)定性增加幅度比較小，當(dāng)E/S 為0.15% 時(shí)，乳化穩(wěn)定性可以達(dá)到45.8%，6%的SPI 溶液的乳化穩(wěn)定性改善幅度較大在E/S 為0.15%時(shí)可達(dá)54.7%。

SPI 的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都先隨酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而提高，當(dāng)E/S 為0.15%時(shí)達(dá)到最大;然后隨著E/S 的增大，乳化活性和穩(wěn)定性降低。這是因?yàn)镾PI 經(jīng)酶解處理后其三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，水解開(kāi)始時(shí)增加了肽的分子數(shù)目同時(shí)暴露出疏水基團(tuán)，相對(duì)增加了蛋白質(zhì)的疏水部分，這在一定程度上增加了乳化活性及穩(wěn)定性。當(dāng)水解程度較大時(shí)，可能部分蛋白分子發(fā)生聚集，從而降低了蛋白中總巰基和游離巰基含量，所以乳化性及乳化穩(wěn)定性降低［16-17］。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)SPI 溶液乳化性能的影響

從圖3 和圖4 可以看出，2% ～4%的SPI 溶液隨著酶解時(shí)間的增加其乳化活性和乳化穩(wěn)定性略微有所下降，但變化不大。5%和6%的SPI 溶液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著酶解時(shí)間的增加先增大，在1h處最大，然后再減小，最后趨于平緩。隨著酶解處理時(shí)間的增加，緊密的大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)變得疏松，分子柔性增加，暴露出更多的疏水基，降低油—水界面的張力，因此，乳化活性及穩(wěn)定性提高。但隨著酶解處理時(shí)間的延長(zhǎng)，使SPI 不能形成穩(wěn)定的膠束，乳化活性及穩(wěn)定性有所下降。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)SPI 溶液乳化活性的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on SPI emulsifying activity

圖4 酶解時(shí)間對(duì)SPI 溶液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on SPI emulsition stability

2.3 酶解SPI 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取SPI 濃度為4%，5%，6%，E/S 為0.05%，0.15%，0.5%，酶解時(shí)間為0.5 h，1 h，1.5 h，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

酶解SPI 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 酶解SPI 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 2 The results and analysis of SPI orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2 極差R 可知，正交實(shí)驗(yàn)中的3 個(gè)因素對(duì)SPI 乳化活性和乳化穩(wěn)定性影響程度的順序是一致的，其中SPI 濃度是最重要的影響因素，其次是酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再次是酶解時(shí)間。由表3 的方差分析中的平方和一項(xiàng)可以進(jìn)一步看出SPI 溶液的濃度是提高其乳化活性和乳化穩(wěn)定性的決定性因素，如果SPI 的濃度選擇不合理，其他酶解條件對(duì)SPI 乳化性能的提高幾乎不起作用;酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)也對(duì)SPI 乳化性能有較大影響。

由圖5 和圖6 可以看出，SPI 濃度6%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%、酶解時(shí)間0.5 h 時(shí)，酶解SPI 的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都分別達(dá)到最高值，而在其他水平上兩個(gè)指標(biāo)相對(duì)較低。因此，正交試驗(yàn)獲得的提高SPI 乳化活性和乳化穩(wěn)定性酶解條件的最優(yōu)組合都為A3B2C1，即SPI 濃度為6%，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%，酶解時(shí)間為0.5 h。按此條件實(shí)驗(yàn)，測(cè)得改性SPI 溶液的乳化活性為66.2%，乳化穩(wěn)定性為52.3%，比原6%的SPI 溶液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了20%和18%。

圖5 各因素對(duì)提高酶解SPI 乳化活性的影響趨勢(shì)Fig.5 The trend of each factor influence on improvement of enzymatic SPI emulsifying activity

圖6 各因素對(duì)提高酶解SPI 乳化穩(wěn)定性的影響趨勢(shì)Fig.6 The trend of each factor influence on improvement of enzymatic emulsition stability

3 結(jié)論

本文對(duì)不同濃度的SPI 溶液針對(duì)提高其乳化性能進(jìn)行研究，考察全面。通過(guò)測(cè)定常態(tài)與離心狀態(tài)下乳狀液的穩(wěn)定程度來(lái)表示SPI 的乳化活性和乳化穩(wěn)定性，該方法較為直觀。研究得出結(jié)論如下:

(1)SPI 溶液的濃度達(dá)到6%，才會(huì)有較高的乳化性能，低于此濃度的SPI 溶液的乳化性能都較低。

(2)酶解改性對(duì)濃度在5%以下的SPI 溶液的乳化性能幾乎沒(méi)有改變，當(dāng)SPI 濃度至少達(dá)到5%以上時(shí)，適當(dāng)?shù)拿附獠拍芷鸬教岣叽蠖狗蛛x蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的作用，過(guò)度酶解則會(huì)引起SPI 乳化性能的下降:酶解的最佳SPI 濃度為6%，最佳酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%，最佳水解時(shí)間為0.5 h，按此條件酶解，改性SPI 溶液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了20%和18%。

［1］ 李玉珍，肖懷秋，蘭立新，等. 大豆分離蛋白功能特性及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］. 中國(guó)食品添加劑，2008，19(1):121 -124.

［2］ Renata Torrezan，Whye Pin Tham，Alan E Bell，et al.Effects of high pressure on functional properties of soy protein［J］.Food Chemistry，2007，104(1):140 -147.

［3］ 郭永，張春紅. 大豆蛋白改性的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］. 糧油加工與食品機(jī)械，2003，34(7):46 -50.

［4］ 邢小鵬，吳高峻. 大豆分離蛋白的功能特性［J］. 食品工業(yè)科技，2000，21(4):74 -76.

［5］ 張平安，趙秋艷，李寧，等. 響應(yīng)曲面優(yōu)化木瓜蛋白酶提高大豆分離蛋白乳化性的研究［J］. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45(5):585 -589.

［6］ 莫文敏，曾慶孝. 蛋白質(zhì)改性研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)，2000，21(6):6 -10.

［7］ 劉志同，裴靜，石冬冬. 酶改性技術(shù)在大豆分離蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］. 糧油食品科技，2003，11(3):11 -12.

［8］ Arun Tapal，Purnima Kaul Tiku. Complexation of curcumin with soy protein isolate and its implicationson solubility and stability of curcumin［J］. Food Chemistry，2012，130(4):960 -965.

［9］ 管軍軍，裘愛(ài)泳，周瑞寶. 提高大豆分離蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的研究［J］. 中國(guó)油脂，2003，28(11):38-42.

［10］ 舒展. 應(yīng)用酶促水解改進(jìn)大豆分離蛋白的乳化性能［J］. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，1992，7(3):39 -43.

［11］ 郭興鳳，慕運(yùn)動(dòng)，阮詩(shī)豐. 不同測(cè)定方法對(duì)大豆分離蛋白乳化性測(cè)定結(jié)果的影響［J］. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(2):129 -131.

［12］ 張根生，岳曉霞，李繼光，等. 大豆分離蛋白乳化性影響因素的研究［J］. 食品科學(xué)，2006，27(7):48 -51.

［13］ Qi H，Hettiarachchy M，Kalapathy NS.Solubility and emulsifying properties if soy protein isolates modified by pancreatin［J］.J Food Sci，1997，62 (6):110 -1 115.

［14］ Roesch RR，Corredig M.Texture and microstructure of emulsions prepared with soy protein concentrate by highpressure homogenization［J］.Lebensmittel Wissenschaft und Technologie，2003，36(1):113 -124.

［15］ 顧振宇，江美都，付道才，等. 大豆分離蛋白乳化性的研究［J］. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2000，15(3):32 -34.

［16］ 徐紅華，劉欣，溫其標(biāo). 復(fù)合酶法改善大豆分離蛋白乳化性的試驗(yàn)［J］. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2008，39(2):103 -106.

［17］ 王述輝，張東杰，王昊，等. 超聲酶法對(duì)大豆分離蛋白乳化性的影響［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工，2011，20(1):54 -56.