錳超氧化物歧化酶模擬化合物誘導人卵巢上皮性癌細胞株SKOV3凋亡的研究

李衛 何援利 米登海

（1．南方醫科大學珠江醫院婦產科，廣東廣州 510282；2．甘肅省第二人民醫院腫瘤科，甘肅蘭州 730000）

錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）主要存在于真核細胞、原核細胞及線粒體基質中，它作為一種重要的抗氧化劑在機體防御疾病的過程中起著重要作用。天然的MnSOD分子質量大、在體內半衰期短、穩定性差、易被蛋白水解，且長期應用可誘發免疫和過敏反應，這些不足限制了其臨床應用［1］。文獻［2－4］報道，人工合成的MnSOD即錳超氧化物歧化酶模擬化合物（mimics of manganese superoxide dismutase，MnSODm）對敏感和耐藥的白血病細胞的活性具有較強抑制作用。我們的試驗也表明，MnSODm對人卵巢上皮性癌細胞株SKOV3的裸鼠移植瘤有治療作用。本實驗研究MnSODm對SKOV3細胞的凋亡效應，并探討其可能的機制。

1 資料與方法

1．1 材料 MnSODm由蘭州大學化工學院劉偉生教授提供，分子式為C40H57Mn2N9O21；SKOV3細胞株購自韓國細胞銀行，RPMI1640培養基為美國GibcoBRL公司產品；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所。活細胞計數試劑盒（cell counting kit－8，CCK－8）購自日本同仁化學研究所，生物潔凈安全柜購自江蘇蘇凈公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染試劑盒購自美國Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養 SKOV3細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下進行培養，每2～3d換液1次，待細胞長滿80%～90%進行傳代。

1．2．2 細胞增殖能力和活性的測定 取對數生長期的SKOV3細胞，以0．25%胰酶消化，計數并接種于96孔培養板內，調整細胞濃度為3×103個／孔，加入 MnSODm（分為3個濃度梯度，即0、10、50μg／mL，0μg／mL為空白對照組）。分別培養0、24、48和72h后，按照CCK－8試劑盒說明書，在上述時間點，每孔加入10μL的CCK－8溶液，將培養板在培養箱內孵育2h，用酶標儀測定450nm處的吸光度，即A值。

1．2．3 PI單染檢測凋亡細胞 加入不同濃度梯度的 MnSODm（0、10、50μg／mL）處理SKOV3細胞72h后，去除上清液，加入200μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，離心并去除PBS，加入冰預冷的70%乙醇固定，4℃放置24h，離心棄去固定液，加入100μL核糖核酸酶（RNase）和PI染液，4℃避光30min，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞變化。

1．2．4 細胞形態學觀察 SKOV3細胞經不同濃度梯度（0、10、50μg／mL）MnSODm處理0、24、48、72h后，在倒置顯微鏡下觀察活細胞數目和形態的改變。

1．2．5 caspase3／7 活性檢測 將對數生長期的SKOV3細胞加于96孔培養板中，依據 MnSODm的不同濃度（0、10、50μg／mL）將其分為3組，分別培養72h，將caspase3／7底物和PBS混合后取100 μL加入以上各孔，37℃反應30min。用熒光分光光度計分析。

1．3 統計學處理 采用SPSS13．0軟件處理數據，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間分析比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 MnSODm處理SKOV3后細胞的增殖能力和活性 MnSODm對SKOV3細胞增殖有明顯抑制作用，對SKOV3細胞活性亦有明顯抑制作用。見表1。

表1 不同濃度MnSODm對SKOV3細胞增殖能力和活性及caspase3／7活性的影響（±s，n）

表1 不同濃度MnSODm對SKOV3細胞增殖能力和活性及caspase3／7活性的影響（±s，n）

注：與同時間0μg／mL濃度組比較，＊P＜0．01

MnSODm（μg／mL） A值0h 24h 48h 72h 72h細胞活性率（%） 72hCaspase3／7活性（RFU）0 0．567±0．021 0．929±0．013 1．457±0．038 1．910±0．033 100．0±1．7 2 618±247 10 0．567±0．021 0．832±0．015＊ 1．100±0．039＊ 1．290±0．045＊ 67．5±2．4＊ 2 753±259 50 0．567±0．021 0．621±0．027＊ 0．558±0．044＊ 0．318±0．018＊ 16．6±0．9＊2 474±221

2．2 細胞凋亡形態學的變化 在熒光倒置顯微鏡下觀察發現，空白對照組細胞生長狀態良好，表現為細胞伸展、透亮且折光性好；而10、50μg／mL Mn－SODm處理后的細胞伸展度降低，部分細胞體積變小、皺縮，折光性差。見圖1。

2．3 PI染色檢測MnSODm對SKOV3細胞凋亡的影響 空白對照組細胞核呈圓形，邊緣清晰，染色均勻；而10、50μg／mL MnSODm處理的細胞核邊緣不規則，染色質凝集，著色較重，核固縮，核著色強陽性細胞數明顯高于空白對照組。見圖2。

圖1 MnSODm作用SKOV3細胞72h后細胞大體觀

2．4 不同濃度 MnSODm對caspase－3／7活性的影響 SKOV3細胞經10和50μg／mL MnSODm處理72h后，caspase－3／7的活性與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。見表1。

圖2 PI染色后熒光顯微鏡下凋亡細胞的改變

3 討 論

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種廣泛存在于生物體內的含銅、錳、鐵等金屬離子的酶，它能夠有效清除活性氧以及氧化過程中產生的超氧陰離子自由基（O2－·），是生物體抗氧化系統的第一道防線［5］。

MnSOD過量表達在多數腫瘤細胞中可抑制細胞生長，其機制尚不明確。目前認為，細胞氧化還原狀態失衡引起細胞生長障礙，MnSOD過量表達使線粒體中的減少，如果分解H2O2的酶未相應增加，H2O2濃度將會增高，引起細胞代謝障礙和生長抑制。高濃度的H2O2和一氧化氮（NO）能夠協同抑制腫瘤生長，原因在于NO在H2O2存在下生成羥自由基（·OH），增加了單鏈 DNA 損傷［6］。MnSOD過量表達時，谷胱甘肽過氧化物酶和H2O2酶代償性增加，NO可能通過抑制H2O2酶的作用而減少H2O2的分解，維持 MnSOD過量表達，使H2O2處于高水平狀態。MnSOD過量表達使細胞對谷胱甘肽（glutathion，GSH）合成阻滯劑—丁胱亞磺酰亞胺的敏感性增加，并使H2O2產生增加，使還原性與氧化性谷胱甘肽（GSSG）的比值即GSH／GSSG減少，這可能與NO敏感性亢進有關。

Bernard等［7］研究顯示，MnSOD過量表達可清除腫瘤壞死因子α（TNF－α）誘導產生的而使細胞凋亡逃逸，但細胞內H2O2蓄積后則會抑制細胞的增生并促進其凋亡，當MnSOD轉化的H2O2超過MnSOD清除的能力時，將會導致由細胞色素C及caspase－3、6、8、9啟動的細胞凋亡。因此，MnSOD過量表達對腫瘤的保護或抑制作用受之間平衡的制約。MnSOD不僅可以通過調節平衡而抑制或促進細胞增殖，還可以通過調節信號轉導相關蛋白促進或抑制細胞凋亡［8］。

本研究結果顯示，MnSODm有促進SKOV3細胞凋亡的作用。MnSODm通過線粒體途徑和死亡受體途徑激發caspase家族活性，從而誘導敏感和耐藥的白血病細胞凋亡［3］。caspase家族成員以無活性的酶原形式存在于細胞內，caspase的活化途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網通路。上述通路最終激活caspase－3、7、6、8、9，誘導細胞凋亡。但本實驗結果表明，MnSODm處理后的SKOV3細胞中caspase－3／7的活性與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0．05），說明MnSODm并非通過激活caspase－3／7而誘導SKOV3細胞凋亡，其誘導SKOV3凋亡的機制尚待進一步研究。

［1］ Kr?mer R．The pharmaceutical potential of manganese－based superoxide dismntase mimics［J］．Angew Chem Int Engl，2000，39（24）：4469－4470．

［2］ 安嫻，魏虎來，祁萍，等．MnSOD模擬化合物誘導人白血病多藥耐藥 K562／ADM 細胞凋亡［J］．現代腫瘤醫學，2008，16（5）：703－706．

［3］ 范臨蘭，魏虎來，竇偉，等．MnSOD模擬化合物通過線粒體途徑誘導K562／ADM細胞凋亡［J］．第四軍醫大學學報，2008，29（24）：2248－2251．

［4］ 范臨蘭，魏虎來，竇偉，等．錳超氧化物歧化酶模擬化合物誘導K562細胞凋亡的機制研究［J］．中國藥理學通報，2009，25（10）：1363－1366．

［5］ Ho JC，Chan－Yeung M，Ho SP，et al．Disturbance of systemic antioxidant profile in nonsmall cell lung carcinoma［J］．Eur Respir J，2007，29（2）：273－278．

［6］ Kim KH，Rodriguez AM，Carrico PM，et al．Potential mechanisms for the inhibition of tumor cell growth by manganese superoxide dismutase［J］．Antioxid Redox Signal，2001，3（3）：361－373．

［7］ Bernard D，Monte D，Vandenbunder B，et al．The c－Rel transcription factor can induce and inhibit apoptosis in the same cells via the uqregulation of MnSOD［J］．Oncogene，2002，21（28）：4392－4402．

［8］ Zhang Y，Gu J，Zhao L，et al．Complete elimination of colorectal tumor xenograft by combinde manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand gene virotherapy［J］．Cancer Res，2006，66（8）：4291－4298．