肝癌肝動脈化療栓塞治療對缺氧誘導因子2α表達的影響及其臨床意義

孫海香 楊欣榮 徐泱 樊嘉，2

（1．復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所，上海 200032；2．復旦大學附屬生物醫學研究院，上海 200032）

肝動脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）是治療中晚期肝癌常選的非手術治療方法。缺氧誘導因子2α（hypoxia inducible factor 2 alpha，HIF－2α）是細胞適應缺氧微環境的重要轉錄因子，是HIFs家族的重要成員之一。HIF－2α參與細胞代謝、增殖、凋亡和血管生成，在非小細胞肺癌、胰腺癌、宮頸癌和結直腸癌等多種腫瘤中表達異常［1－2］。目前，關于 HIF－2α在肝癌中的表達研究較少，且爭議頗多［3－6］。本研究旨在探討 TACE治療對肝癌組織中HIF－2α表達水平的影響，并分析其表達水平與其他病理因素的相關性，企盼闡明HIF－2α在肝癌的發生、侵襲與轉移中的作用機制。

1 資料與方法

1．1 一般資料 采用復旦大學附屬中山醫院2001—2005年經TACE治療后手術切除的157例肝癌患者的肝癌組織，用于組織芯片染色。組織芯片的制備參考Gao等［7］的作法。從上述157例肝癌組織中隨機選取30例肝癌組織；同時收集未經TACE治療而直接行手術切除的30例肝癌患者的肝癌組織。

1．2 試劑 RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；實時熒光定量逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒（日本 Takara公司）；HIF－2α及3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程公司合成；HIF－2α及GAPDH抗體（英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗免疫組化試劑盒（上海長島生物技術公司）。

1．3 RT－PCR檢測 HIF－2α基因表達 肝癌組織RNA抽提參照Trizol試劑盒說明書操作。HIF－2α和GAPDH的引物序列同參考文獻［4］，按試劑盒說明書操作，反應條件為：94℃預變性5min后；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環；最后72℃延伸10min。

1．4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測 HIF－2α蛋白表達 采用考馬斯亮藍法（Bradford法）檢測標本組織抽提液中總蛋白的濃度，操作步驟參照說明書。

1．5 免疫組織化學（IHC）方法檢測 HIF－2α蛋白分布 采用IHC－SP法，參照試劑盒說明書進行操作。按照陽性細胞數占同類計數細胞的百分比，將染色結果分為低表達與高表達，以50%為標準。

1．6 統計學處理 采用SPSS 12．0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 TACE治療后肝癌組織中 HIF－2α的表達TACE治療后肝癌組織中HIF－2α的mRNA水平顯著上升（P＜0．05），見圖1A；Western blot也顯示，TACE治療后HIF－2α蛋白表達水平顯著上升，與非TACE治療而直接手術治療的肝癌患者的HIF－2α表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0．05），見圖1B。

圖1 TACE組和手術組術后肝癌組織中HIF－2α的mRNA及蛋白的表達水平

2．2 IHC分析TACE治療后肝癌組織中 HIF－2α的表達分布 IHC顯示，HIF－2α蛋白陽性信號主要定位于肝癌細胞的細胞核和胞漿中，呈棕黃色或者褐色，見圖2。

圖2 肝癌組織中HIF－2α表達情況（A～C：×100；D～F：×200）

2．3 HIF－2α在TACE治療的肝癌患者中的臨床意義 甲胎蛋白水平、γ－谷氨酰轉肽酶水平、腫瘤直徑和包膜完整性與肝癌患者的總體生存時間（overall survival，OS）相關（P＜0．05）；γ－谷氨酰轉肽酶水平、腫瘤直徑和包膜完整性與肝癌患者的無瘤生存時 間 （disease－free survival，DFS）相 關 （P＜0．05）；HIF－2α蛋白表達水平與肝癌患者的 OS相關（P＜0．05），而與DFS無關（P＞0．05）。

3 討 論

TACE是中晚期肝癌常用的治療方法。TACE既可直接在腫瘤組織中施以藥物殺傷癌細胞，又可栓塞供養腫瘤的血管，阻斷腫瘤血供，致腫瘤組織缺血、缺氧，進而使腫瘤失去活力。HIF－2α能調節腫瘤壞死因子－α、c－Myc、血管內皮生長因子、Twist等多個在腫瘤生長、轉移和血管生成等過程中起著重要作用的基因的表達。目前，關于HIF－2α在肝癌中的研究相對較少，其作用也有爭議。有研究［6］指出，HIF－2α表達水平與肝癌中的血管密度相關，HIF－2α水平高的患者預后較差。也有研究［4］表明，HIF－2α可促進肝癌細胞自噬、凋亡，提示HIF－2α可能在肝癌發生過程中起著抑制作用。也有研究［8］發現，HIF－2α參與E2F1信號通路，促進細胞凋亡，肝癌組織中HIF－2α的表達水平與腫瘤直徑呈負相關。本研究發現，TACE治療后肝癌組織中HIF－2α的表達水平顯著上升，并且其表達水平與肝癌患者的OS相關，這進一步證實HIF－2α參與了肝癌的發展。進一步深入研究HIF－2α的功能及其作用機制，將對肝癌的治療具有十分重要的意義。

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