胰蛋白酶抑制劑的結構與功能研究進展

王榮春，孫建華，何述棟，馬 鶯,*

(1.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010)

1 胰蛋白酶抑制劑的分類及結構

胰蛋白酶(Trypsin)在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。其在胰臟以酶的前體——胰蛋白酶原被合成的。胰蛋白酶原受腸激酶或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。其不僅起消化酶的作用，而且能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用。

胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor，TI)普遍存在于自然界的動物、植物和微生物中，目前，研究較多的胰蛋白酶抑制劑主要來源于人類主要的糧食，如豆科、喬本科，在十字花科中也有報道。而在動物界中，動物的血液、胰臟，以及酵母菌、鏈霉菌屬等微生物中亦有胰蛋白酶抑制劑的存在。蛋白酶抑制劑可分為絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金屬蛋白酶抑制劑4大類。而胰蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteinase inhibitor，Serpin)家族。

1.1 胰蛋白酶抑制劑的分類

胰蛋白酶抑制劑可以與胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶系(如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)發生不可逆的反應。胰蛋白酶抑制劑與其靶酶的相互作用，通常與酶和底物之間的相互作用一樣，屬于互補型作用機制。胰蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶(或糜蛋白酶)相互反應時，抑制劑暴露在外的活性中心(反應位點)與靶酶的活性中心通過氫鍵相連，形成穩定的復合物，從而導致酶活性中心的閉鎖，使靶酶的活性喪失，且此反應是不可逆的。與通常的酶催化反應相比，胰蛋白酶與其抑制劑之間反應的米氏常數(Km)很低，故胰蛋白酶與其抑制劑的親和力大，兩者可以迅速結合成無活性、不可逆的復合物。與一般的酶的底物不同，酶對抑制劑的反應位點的肽鍵并不能作用，抑制劑與酶結合后其活性中心的肽鍵并不裂解或裂解速率極慢。因此，該復合物雖然可以分解成游離的酶和變性或未變性的抑制劑，但解離速率非常緩慢[1]。

1.2 胰蛋白酶抑制劑的結構

胰蛋白酶抑制劑根據分子質量、半胱氨酸含量、反應位點的數量主要可分為Kunitz型抑制劑、Bowman-Birk型抑制劑、PotatoⅠ型、PotatoⅡ型及Kazal型。其中研究最為廣泛和深入的是Kunitz型抑制劑及Bowman-Birk型抑制劑兩類，分別是庫尼茲胰蛋白抑制劑(Kunitz type Trypsin inhibitor，簡稱KTI)和鮑曼-貝爾克胰蛋白酶抑制劑(Bowman-Birk type Trypsin inhibitor，簡稱BBTI)。

1947年，Kunitz[2]首次自大豆中分離和結晶出Kunitz胰蛋白酶抑制劑，發現其分子質量約20.1kD，其半胱氨酸含量相對低，分子內含有2個二硫鍵和1個反應位點，該反應位點一般只能與胰蛋白酶相互作用[3-4]。大豆中的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，分子內含有181個氨基酸殘基，2個二硫鍵(Cys39～Cys86、Cys138～Cys145)，分子中多以松散的線團狀的分子存在，位于138位和145位的半胱氨酸之間形成了二硫鍵，結合形成了一個由8個氨基酸組成的小環，另外在39位和86位的半胱氨酸之間形成了第2個二硫鍵。其活性中心位于第63位的精氨酸和第64位的異亮氨酸，這2個氨基酸位于分子的外部，并且一個KTI分子抑制劑能鈍化1個分子胰蛋白酶。其他來源的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑也被陸續研究。而來自牛的胰腺的胰蛋白酶抑制劑也屬于Kunitz型，其分子質量為6.5kD，含有3個二硫鍵，但同樣只有1個反應位點。利用晶體學和圓二色性方法研究大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的蛋白結構主要由β折疊組成，同時由12組反向平行的β-股以疏水側鏈、隨機卷曲和轉角結構穩定形成的十字交叉的區域[5]。Kunitz型胰蛋白酶抑制劑已經從刺桐(Erythrina)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolebus)、牧豆樹(Prosopis julifl ora)、葵花籽、洋紫荊(Bauhina variegata)、鳳凰木(Delonix regia)、豬屎豆(Crotalaria paulina)、黎豆(Mucuna pruriens)、海紅豆(Adenanthera pavonina)、棕色腰豆等植物的種子及土豆等提取獲得[6-14]。

Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑(BBTI)于1946年由Bowman[15]自大豆中分離獲得。該Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的分子質量大約為8kD，富含半胱氨酸，包含2個反應位點及7個二硫鍵。2個反應位點分別抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應位點的單邊結構呈現環狀結構。一環狀結構為胰蛋白酶結合區域含有4個二硫鍵，可抑制胰蛋白酶的活性，而另一環狀結構為胰凝乳蛋白酶的結合區，存在3個二硫鍵，可與胰凝乳蛋白酶相結合抑制其活性。由于分子內富含二硫鍵和亞基間的極性相互作用，這些BBTI的熱穩定性和酸堿穩定性較好[16]。目前已從多種來源中分離純化得到BBTI。Song等[17]自中國竹臭蛙的皮膚分泌物中提取獲得只有62個氨基酸的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑。Ye等[18]自蠶豆中，利用色譜法分離了分子質量為7.5kD的Bowman-Birk型抑制劑，其具有抗菌作用，可抑制HIV-1反轉錄酶活性，同時對鼠的脾細胞具有促進增殖的作用。

PI-Ⅰ和PI-Ⅱ家族是一類誘導型的蛋白酶抑制劑。其中PI-Ⅰ家族包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ和番茄蛋白酶抑制劑Ⅰ，它們的分子質量為8.1kD，只有1個活性中心，主要抑制胰蛋白酶，而對胰凝乳蛋白酶抑制作用較弱。PI-Ⅱ家族包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ和番茄蛋白酶抑制劑Ⅱ，由2個重復序列構成，分子質量為24kD，包含2個活性中心，能抑制胰蛋白酶和凝乳蛋白酶。而關于Kazal型胰蛋白酶抑制劑的研究進展，鄭青亮等[19]作過較全面的綜述。

2 胰蛋白酶抑制劑的生物功能

胰蛋白酶抑制可以與生物的胰蛋白酶結合，不可逆形成無酶活性的復合物，從而抑制了生物對蛋白質的消化、吸收和利用等能力，也因此被稱為抗營養因子。而昆蟲攝入蛋白酶抑制劑后，其與昆蟲腸道的蛋白酶形成穩定的復合物，從而使昆蟲的蛋白消化酶活性受到抑制。同時，蛋白酶和蛋白酶抑制劑的復合物還可能作為一個負反饋信號抑制昆蟲的進食。這種重效應將降低害蟲對食物蛋白的有效利用率同時也減少了食物的攝取，最終導致昆蟲由于缺乏必需的營養(蛋白質)停止發育并最終死亡。抗蟲害是胰蛋白酶抑制劑的生物功能。胰蛋白酶抑制劑的生理作用除了抗微生物、抗蟲害外，其對生物的生長發育，甚至細胞的凋亡也都有調節作用。而近些年來人們也注意到了胰蛋白酶抑制劑的抗病毒和抗癌作用，并廣泛開展了這方面的相關研究。

在抗病毒方面，Evandro等[20]自豆類中提取了Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，該抑制劑可以抑制對HIV-1增殖至關重要的HIV-1反轉錄酶的活性，從而使得此胰蛋白酶抑制劑具有了抑制HIV-1增殖的可能性。Ye等[18]發現來自蠶豆的Bowman-Birk型抑制劑也同樣具有抑制HIV-1反轉錄酶活性的作用。這些研究都說明胰蛋白酶抑制及具有抑制病毒增殖的可能性。

在抗腫瘤方面，Ho等[21]自北海道黑豆中提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑顯示了對MCF-7乳房癌細胞增殖的抑制作用，此研究也表明了該胰蛋白酶抑制劑可能具有抗癌的作用。Kobayashi等[22]報道了自大豆中提取的胰蛋白酶抑制劑通過下調uPA尿激酶纖維蛋白溶酶原激活物從而阻止卵巢癌細胞的擴散，該研究同樣證實了胰蛋白酶抑制劑可能存在抗癌的生理活性。自蠶豆中提取、分離獲得了分子質量為15kD的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑，除了可以抑制HIV-1的反轉錄酶的活性外，同時具有通過誘導染色質凝聚和細胞凋亡而抑制HepG2肝腫瘤細胞增殖的能力。Evandro等[23]自宮粉羊蹄甲提取的一種新型的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(BvvTI)，除了具有抑制HIV-1的反轉錄酶的活性外，還可明顯地抑制鼻咽癌細胞CNE-1增殖作用，同時對細胞活素類和細胞凋亡都有影響。

胰蛋白酶抑制劑的這些生物活性賦予了應用于醫藥的潛力[24]。但關于胰蛋白酶的抑制劑對腫瘤細胞和HIV-1的逆轉錄酶的抑制機制到目前為止還未明確，需要進一步的研究探討。

3 胰蛋白酶抑制劑的提取及純化方法

3.1 提取

因胰蛋白酶抑制劑多為小分子，帶微弱電荷的蛋白質分子，大多數胰蛋白酶抑制劑的提取研究中，采用水作為提取溶劑，如Ee等[25]利用10倍體積的無菌水將研磨后的金合歡種子在4℃的條件下攪拌2h，進行胰蛋白酶抑制劑的提取。同時也可利用低濃度的酸性水溶液、鹽溶液或中性的緩沖液對胰蛋白酶抑制劑進行提取。王轉花等[26]曾經分別用磷酸緩沖液、0.2mol/L硫酸、0.4mol/L三氯乙酸以及水提法從苦蕎種子中提取胰蛋白酶抑制劑，對4種提取方法所得產物的抑制活性及柱層析純化結果比較表明，以磷酸緩沖溶液為提取介質，經熱變性、鹽析及Sephadex G-100柱層析分離后苦蕎胰蛋白酶抑制劑的活性和得率較高，是較為理想的提取方法。Liu等[27]利用冰冷的50mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH6.5)自西番蓮果中粗提胰蛋白酶抑制劑。在該研究中，為了避免西番蓮果中各種成分間的反應，在提取之前，利用液氮作為研磨助劑。對于植物基質和動物基質的提取前處理略有不同，對于植物基質的提取去脂等步驟并非必不可少，但對于動物組織的基質，由于富含脂類和糖類物質，所以前處理往往是必需的且較為復雜。

3.2 純化

利用各種溶劑提取獲得的粗提物同時還含有較多其他種類的蛋白質，胰蛋白酶抑制劑的結構研究和性質研究則要求必須對粗提物進行純化或精制。因粗提物中的蛋白種類繁多，單一依靠胰蛋白酶抑制劑的某一性質很難將其從諸多蛋白質中純化出來，所以，對胰蛋白酶抑制劑的純化一般是在利用離心、鹽沉后再用純化效率較高的色譜法進行進一步純化，且多為2種以上的色譜法結合使用進行分離純化，如離子色譜與排阻色譜結合，或離子色譜與親和色譜相結合等。在色譜分離之前也可利用梯度鹽析(一般常使用為硫酸銨)的方法進行初步分離[28]。在色譜分離后利脫鹽，再經冷凍干燥獲得純化物質。如Zhang等[29]在提取青蛙皮膚分泌物中胰蛋白酶抑制劑時，首先利用含有0.1mol/L NaCl和5mmol/L EDTA的50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液將青蛙皮膚上的分泌物洗溶于該溶液中，離心去除不溶物，再利用DEAE-瓊脂糖A-50離子交換色譜柱(2.6cm×30cm)進行第一次色譜分離。洗脫的含有胰蛋白酶抑制活性的部位將被進行第二次分子質量色譜分離，使用的色譜柱為瓊脂糖凝膠G-75(2.6cm×100cm)，獲得的具有活性的部位被冷凍干燥后進行脫鹽。

利用胰蛋白酶固定于色譜柱的填料中，制成親和色柱，利用這樣的色譜柱可實現對胰蛋白酶抑制劑進行一步式純化。但由于成本原因，現階段這種純化方法未得到廣泛應用[30-31]。如Zhang等[32]利用殼聚糖將一蛋白酶抑制劑進行了固定化，并檢測到其在熱和酸堿條件下有著優于天然胰蛋白酶抑制劑的穩定性，且引法能對大豆胰蛋白酶抑制劑進行較快速的分離純化，具有應用于工業的潛力。

4 胰蛋白酶抑制劑蛋白質結構的研究方法

蛋白結構研究是胰蛋白酶抑制劑研究的重要內容。研究胰蛋白酶抑制劑的研究方法大多采用已成熟的蛋白質結構分析方法，如X射線衍射法、圓二色光譜法(CD)、核磁共振法(NMR)等。Shee等[5]探討了自咖喱仔中提取的胰蛋白酶抑制劑的蛋白質結構及其與穩定性的關系。該研究闡明在CD研究中顯示，這種胰蛋白酶抑制劑在自然條件下，含有大約46%的β-股、30.1%的α-螺旋、16.2%的轉角以及6.9%的隨機卷曲。當溫度上升，α螺旋可轉變成卷曲，其對胰蛋白酶的抑制活性和α螺旋的含量有關。同課題組[33]對該胰蛋白酶抑制劑的結晶結構也進行了初步的X射線衍射分析，以PEG-8000作為沉淀劑利用坐滴氣相擴散法獲得Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，其結晶為四方晶系，晶胞參數為a=b=75.8、c=150.9?。Zhao等[34]利用NMR方法，分析了來源于擬南芥的胰蛋白酶抑制劑的三維結構，這種蛋白包括一段α螺旋、兩段由β折疊形成的反平行結構，同時這兩段節后連接有β轉角結構。α螺旋和抑制環區域與β折疊通過3個二硫鍵相連接，4個二硫鍵將蛋白質的N末端和C末端相連接。對胰蛋白酶抑制因子的結構討論中，近年來利用計算機模擬和X射線衍射法、CD、NMR相結合的方法也有報告[13,35]。圖1為來源于豇豆的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的蛋白質三維結構，該蛋白有2個相似的亞基，每個含有30個氨基酸殘基、14個半胱氨酸，形成了7個二硫鍵，為典型的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的蛋白質結構[36]。

對于胰蛋白酶抑制劑的蛋白質結構和功能之間的研究還有很多可探討的空間，尤其是結構與抗腫瘤、抗病毒等功能之間的關系，以及功能的作用機制等問題，需要進一步研究。

圖 1 自豇豆提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的蛋白質結構[36]Fig.1 Protein structure of the Bowman-Birk trypsin inhibitor from Vigna unguiculata seed[36]

5 胰蛋白酶抑制劑的臨床應用及潛在應用

胰蛋白酶抑制劑在很多方面具有應用的潛力，包括：1)胰腺可產生多種消化酶，如胰蛋白酶、脂肪酶、糜蛋白酶等，胰蛋白酶原沒有活性，當受到膽汁和腸液中的腸激酶的激活后，產生活性，而胰蛋白酶有可能激活其他的酶，這些酶對胰腺產生消化作用，對胰腺造成傷害。由于胰蛋白酶抑制劑對絲氨酸蛋白酶具有光譜的抑制作用，可以結合胰蛋白酶和胰凝乳酶等消化酶，使消化酶失活，從而治療由于消化酶過多而對胰腺造成了損傷的胰腺炎。2)有研究表明胰蛋白酶抑制劑與內源抗蟲物質具有協調性，可增加抗蟲性，因此如果將外源蛋白酶抑制劑的基因轉入具有內源性抗蟲次物質的植物，可能會獲得具有高抗蟲性的新品種。很多學者做了此方面的嘗試，如Hilder等[37]將豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因成果轉入煙草葉片中，并得以表達，提高了煙草的抗蟲害性。3)如前面所述，胰蛋白酶抑制劑對腫瘤細胞的增殖和HIV-1反轉錄酶的活性具有抑制作用，而大豆中Bowman-Birk的胰蛋白酶抑制劑，被研究證明具有阻止細胞惡性化，降低多種癌癥發病率的作用，如肺癌、子宮內膜癌、乳腺癌等作用，蛋白酶抑制因子與受體的結合能夠調節蛋白酶的活性，抑制其對基底膜的浸潤，阻斷腫瘤細胞的轉移。因此胰蛋白酶抑制劑有治療癌癥和抗病毒的可能性。

6 結 語

胰蛋白酶抑制劑作為小分子的功能蛋白，其提取分離、結構特性及功能特性的研究方法日趨成熟，但對于蛋白質的結構和功能的關系、生理功能的作用機制(如抑制腫瘤細胞增殖的機制等)以及胰蛋白酶抑制劑的應用等問題還有待解決，而這些問題的解決需要多個領域的技術相結合才能得以完成。

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