脫酰胺改性蛋白和肽的研究進展

廖 蘭，趙謀明*，汪少蕓，黎清金

(1.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

脫酰胺反應是一種蛋白或肽分子修飾改性重要的手段。脫酰胺顧名思義為蛋白側鏈酰胺的基團脫去轉變為羧基的反應。自然界中大多數食物蛋白富含酰胺基團。該反應可快速改變蛋白電子分布狀態，伸展食物蛋白分子空間結構，使食物蛋白獲得良好的功能特性，拓寬其應用范圍[1]。Matsudomi[2]、Hamada[3]等指出食物蛋白僅2%～6%的脫酰胺改性程度能顯著地提高食物蛋白的功能特性。人體蛋白質和肽也發生著脫酰胺反應，且呈現周期性。該脫酰胺反應導致了人體蛋白和肽異構化，引發人體蛋白和肽的反轉、延展和老化等，對人體衰老和免疫有重要影響[4-5]，是導致人體亞健康、誘發各種醫學難癥的重要原因，如：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)發病的神經原纖維團特征與大腦T-蛋白發生脫酰胺反應緊密有關；人體血清蛋白脫酰胺將改變了其抗原屬性，導致自抗原效應。

圖 1 蛋白酰胺基團直接水解機制Fig.1 Direct hydrolysis of the amides from proteins and peptides

科學家們研究發現蛋白或肽的酰胺基團脫去酰胺以兩種機制進行[6]：l)直接水解反應機制(圖1)；2)β-轉變機制(β-shift mechanism)(圖2)。一般情況下，在pH＜5的條件下，蛋白質或肽直接水解脫去酰胺基團，在較高的pH值條件下(pH＞5)則發生β-轉變機制。直接水解反應機制較易理解，即酰胺基團在H+或OH－或酶催化下，以水為反應介質，酰胺鍵斷裂，形成羧基。因此，酰胺基團需先從蛋白質或肽聚集結構內暴露，轉變成脫酰胺催化劑有效作用反應位點，并與水與H+接觸，脫酰胺反應才可啟動。

β-轉變機制(圖2)較復雜，除了酰胺基團首先需暴露，該反應生成了一種含有五或六元碳的酰胺中間體(琥珀酸亞胺中間物)，該特殊中間體極不穩定，當釋放氨后，立即水解生成“異頭肽”(isoPeptide)[7](isoAsp–Xaa和isoAsp–Xaa混合體)。Aswad等[7]研究指出isoAsp異頭肽的形成會顯著降低蛋白的生物活性，使蛋白水解敏感性和自免疫力降低。通常，人體生理環境中性偏堿，人體生物蛋白或肽的脫酰胺反應以β-轉變機制為主。

圖 2 β-轉變脫酰胺機制Fig.2 β-Shift mechanism of the amides from proteins and peptides

不管以何種機制進行脫酰胺反應，蛋白質或肽的酰胺基團暴露途徑、暴露程度、催化劑作用位點的特點和作用效果、蛋白或肽聚集態和結構特征如何影響脫酰胺是本領域研究的關鍵點。一直以來，由于蛋白或肽本身體系組成復雜和結構多樣，導致蛋白或肽脫酰胺的構效關系研究成為難點。本文通過綜述以往文獻關于各類脫酰胺改性蛋白和肽的報道及其原始蛋白或肽結構特征和改性過程中聚集態特征，在某種程度上對蛋白和肽的結構特征與其脫酰胺能力的關系進行歸納，并在此基礎上提煉出對未來發展方向的預測。

1 脫酰胺改性蛋白和肽的方法研究進展

目前，脫酰胺改性蛋白常用的方法分為非酶法、酶法、混合脫酰胺3種。Zhang等[8]研究發現在無水的環境下也有脫酰胺的作用，且脫酰胺速率隨反應時間延長而提高。在食品生產加工或者人體胃消化環境中，蛋白或肽常處于的偏酸條件環境，酶脫酰胺和非酶酸脫酰胺改性蛋白和肽的研究因而較多。非酶堿性脫酰胺會破壞Cys，形成賴氨酸丙氨酸，毒理研究表明賴氨酸丙氨酸對小鼠腎有毒害作用，導致蛋白營養價的下降。

1.1 酶法脫酰胺

酶法脫酰胺改性食品蛋白和肽已引起了眾多學者的興趣。如表1所示，目前用于脫酰胺改性食品蛋白的各種酶系及改性效果的研究[2-3,9-16]可知：具有脫酰胺作用酶系較豐富，效果明顯。其中從微生物中提取分離純化出肽谷酰胺酶(PGase)脫酰胺改性蛋白效果顯著[3]。科學家研究認為PGase脫酰胺改性蛋白最實際、可行，但前提條件是蛋白質需先被其他蛋白酶或其他方法預處理才是最適底物，因為蛋白質分子的大小和構象顯著地影響該酶的催化活性。酶法脫酰胺也可顯著提高蛋白水解物的風味特性[16]，Schlichtherle-Cerny等[16]分離純化得到4個鮮味肽：Gln-Pro-Ser、Glu-Pro、Glu-Pro-Glu、Glu-Pro-Gln都是N端谷氨酰胺殘基在脫酰胺過程中環化而形成。此外，從表1可知，堿性和低溫是酶法脫酰胺改性蛋白常使用的條件，說明是酶法脫酰胺是改性食物蛋白制備良好功能特性的安全、高效方法之一，但同樣，其缺點在于：底物需經一定的物理、化學或生物手段改性，使蛋白或肽的構象伸展，即酰胺基團需先充分暴露，改造成脫酰胺酶系有效作用反應位點，其脫酰胺作用才能有效被啟動。相對而言，非酶脫酰胺更加直接高效。

1.2 非酶法脫酰胺

溫度是影響蛋白和肽脫酰胺速率的重要條件之一，濕熱成為非酶酸脫酰胺改性食物蛋白的必要條件。較高的溫度提高了反應體系離子和分子的動能和內能，有利于增大催化劑與酰胺基團接觸的幾率，進而加快脫酰胺反應進程。鹽離子和控制溫度、濕度和pH值的雙螺桿擠壓法也會產生較好脫酰胺效果[8,17-21]。改性后蛋白電點隨脫酰胺程度的增加，向低pH值移動，功能性質(乳化性能以及起泡性)均有不同程度的改善(表2)。

表1 脫酰胺改性蛋白或肽的酶系Table 1 Working enzymes for deamidation of proteins and peptides

表2 非酶法脫酰胺改性蛋白或肽Table 2 Unenzymatic deamidation of proteins and peptides

酸是最常使用脫酰胺改性蛋白的催化劑。理論上，任何能電離出氫離子的酸都可作為蛋白或肽脫酰胺的催化試劑。濕熱酸脫酰胺具有的優點是：1)改性蛋白質的脫酰胺度較高，改性蛋白的溶解度明顯增加，其他性質例如乳化性和起泡性也顯著提高；2)有利于增加必需氨基酸(如賴氨酸)的消化和吸收量。由于食物蛋白反應體系要求特別，國內外學者常采用低濃度鹽酸應用于脫酰胺改性蛋白反應，但不管高還是低濃度鹽酸都有如下明顯的缺點：1)高溫條件下高濃度鹽酸水解脫酰胺蛋白，將產生致癌物氯丙醇，導致食品安全問題；2)高溫低濃度鹽酸催化蛋白脫酰胺，由于作用溫度高，其肽鍵水解難控制，蛋白質易部分變性，引起一些氨基酸(如色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及含硫氨基酸)的異構化以及破壞。近年來，幾種常用可食性有機弱酸開始作為脫酰胺催化試劑用于脫酰胺改性食物蛋白，特別是谷物蛋白，并取得了有益的研究成果(表2)[28-29]。值得提出的是，Berti等[28]研究指出高溫濕熱醋酸脫酰胺導致腸胃抗-醇溶免疫球蛋白抗體的免疫活性降低，TG酶法脫酰胺導致腸胃抗-醇溶免疫球蛋白抗體的免疫活性提高。并且，本課題組也研究指出有機弱酸在濕熱條件下具有同強酸同等脫酰胺能力，且對肽鍵水解作用微弱，能更專一作用于蛋白側鏈酰胺基團進行脫酰胺改性，可有效地伸展了小麥面筋蛋白的二級、三級結構，顯著改善小麥面筋蛋白的功能特性，保持并提高了小麥面筋蛋白營養特性[29]。以上研究結果表明，高溫濕熱有機酸脫酰胺是一種既能提高小麥面筋蛋白功能特性，又能降低腸胃病人對小麥面筋不耐受癥，是谷物蛋白脫敏的有效方法。

2 蛋白質或肽的原始結構對蛋白脫酰胺反應的影響

蛋白質或肽的結構特性是影響其脫酰胺處理和改性程度的重要因素。Robinson等[4]和Wright[10]兩課題組提出了脫酰胺半衰期和分子鐘假說，先后圍繞著人工合成的肽和酰胺基側鏈等較明確的蛋白立體化學，從蛋白或肽的主鏈、4種二級和三級結構入手，研究Asn或Gln發生脫酰胺速率的關聯性和影響，闡述了各種環境條件下的不同蛋白中的酰胺基團斷裂或周圍肽鍵斷裂的機制。

2.1 蛋白質或肽的主鏈(一級結構)對蛋白脫酰胺反應的影響

目前，主鏈對蛋白或肽脫酰胺反應的研究，是通過基因控制改變氨基酸序列，來調整蛋白脫酰胺速率。脫酰胺反應機制的經典理論認為，Asn殘基脫酰胺速率高于Gln殘基。有研究也發現，在Asn任何一側的肽鍵斷裂的速率是其他肽鍵斷裂斷裂速率的100倍以上[30]，原因是鄰近的主鏈上—NH基團到Gln側鏈酰胺基團的距離大于到Asn側鏈酰胺基團的距離。可以從脫酰胺的兩種機制來解釋：1)在直接水解機制中，—NH基團作為氫鍵的質子提供者穩定肽中Asn含氧陰離子的過渡態中間產物，但是只能對Gln的過渡態中間產物有非常弱的作用。第二個谷氨酰胺側鏈基團的其他甲基因空間位阻作用使得－NH－基團到過渡態產物中負電氧距離較遠，因而而不能形成較強作用的氫鍵。2)在β-轉變機制中，當Asn左右緊鄰氨基酸是Gly，此Asn發生脫酰胺速率遠高于當Gln左右緊鄰氨基酸是Gly的蛋白序列[31]。Geiger等[32]人工合成了六肽L-Val-L-Tyr-L-Pro-L-Asn-L-Gly-L-Ala，通過模擬改變蛋白結構和功能特性的自然處理條件，研究天冬氨酰胺脫酰胺和異構化反應。實驗發現37℃、pH7.4條件下，該肽發生了快速的脫酰胺反應(半衰期只有1.4d)，生成的了天門氨琥珀酸亞胺產物，并且在該條件下，生成的天門氨琥珀酸亞胺繼續發生水解反應(半衰期2.3h)和異構化(半衰期19.5h)，生成由L-和D-天門氨酰和β-異頭天冬胺酰六肽組成的網絡狀混合物。他們也發現，當用天冬氨酸替代天冬氨酰胺殘基，該六肽生成琥珀酸亞胺的速率下降34倍，伴隨著非常明顯的消旋，以及六肽的脫酰胺和異構化。并且，通過計算琥珀酸亞胺中間產物快速的異構化趨勢，預測蛋白消旋后的產物，并指出：如果用較大空間結構的Leu或Pro殘基替代了含有Asn的六肽中Gly殘基，脫酰胺速率將降低33～55倍。該研究表明，天冬氨酰胺和天冬氨酸可能是蛋白非酶脫酰胺的熱點，特別是在紅細胞和眼球晶體細胞中，他們都各自有120d和80d的生命半衰期。蛋白脫酰胺過程中，肽鍵也會斷裂，特別是在β-轉變機制中，研究人員發現，Asn殘基發生脫酰胺反應的同時，立刻發生肽鍵斷裂[33-34]。Geiger等[32]在構建的肽模型中也發現了有限肽鍵斷裂的現象。在此反應中Asn的側鏈—NH2基團是親核物，進攻其自身主鏈的蛋白羰基，替代Asn羰基一側基團，使其成為不穩定的Asn。

但是近半世紀以來，科學家們所得的相關人體生物活性蛋白經典脫酰胺機制，主要是關于天冬氨酰胺在生理環境條件下的反應機制[6]，而谷氨酰胺因其在人體生理環境下脫酰胺速率顯著小于天冬氨酰胺[31]，并且因在脫酰胺反應位點顯著損傷，被學者關注較少。Asn殘基的脫酰胺速率(包括直接水解機制和琥珀酸亞胺中間產物機制)主要受(n+1)的羰基側鏈控制，較小受(n－1)氨基酸側鏈的作用的影響[35]。然而，(n+1)的羰基側鏈殘基的大小或者電荷和脫酰胺的速率之間的相關性并不清楚。也有研究表明，Asn-Gly或Asn-Ser是脫酰胺最敏感的氨基酸序列[35-36]。對于β-轉變機制，常規的研究思維是：首先，根據靜電感應與作用和蛋白序列，得到(n+1)骨架的氮實際酸度；然后，為合理調試3D蛋白側鏈或主鏈，對其結構重排、設計開、閉脫酰胺中間四、五元環，計算Asn殘基附件有效的構象和空間位阻，以控制環合中間琥珀酸亞胺產物的形成。最后，計算水或者質子對Asn的接近程度，以分解循環四面體中間產物[35]。通過細致的研究，已發現人體生理溶液環境里的Asn殘基的脫酰胺速率在很大程度上是受它們所存在的化學環境影響[36]。由此，Robinson等[4]研究了一種方法可定量估算人體蛋白天冬氨酰胺殘基脫酰胺不穩定性，通過觀察不同五肽中每一個Asn殘基在蛋白三維立體環境中的幾方面特征，并通過計算所得的觀察值、主鏈氨基酸序列以及根據前面已形成的整套根據氨基酸序列決定Asn五肽脫酰胺速率的相關理論。在評估了的31種不穩定和167種穩定的Asn殘基，以及在61種人體血紅蛋白中報道的7種不穩定的和63種穩定的Asn殘基后，他們認為主鏈結構和三維立體結構式影響Asn脫酰胺速率的相對重要性，并得到了以下重要規律：1)Asn和Gln前如果有極性的基團促進脫酰胺速率；2)Asn和Gln附近是Ser和Thr促進脫酰胺速率，它們能夠提供質子使Asn遠離或者穩定在過渡狀態；3)Asn和Gln前如果有龐大的疏水性基團抑制脫酰胺；4)Asn前是Gly會延長Asn的脫酰胺半衰期到1.4d[35]；5)中性條件下Asp、Glu和His側鏈是親核物，能夠主動進攻酰胺鍵，可以作為堿性活潑親核試劑激活酰胺鍵；6)Lys和Arg緊鄰Asn和Gln可穩定脫酰胺過程中形成的含氧陰離子中間產物[37]。

2.2 蛋白質或肽的二級結構對蛋白脫酰胺反應的影響

Asn、Asp、Gln和Glu對不同的二級結構顯示出不同的脫酰胺能力。雖然Asn、Asp、Gln和Glu在α-螺旋都可以形成，但Asp和Glu更易在α螺旋片段中形成[37-38]。在一個螺旋開端的蛋白肽鏈，Asn在大量的螺旋蛋白質二級構象中比在其他氨基酸構象中具有更顯著更高的脫酰胺速率[39]。研究發現，Asn和Gln常存在于蛋白的表面[39]，這樣的蛋白結構特征非常有利于發生脫酰胺反應。天冬氨酰胺的脫酰胺反應中，α螺旋和β折疊都趨于穩定脫酰胺中的天冬氨酰胺殘基。

2.3 蛋白質或肽的三級結構對蛋白脫酰胺反應的影響

蛋白質或肽脫酰胺速率易受其一級、二級結構影響，但Asn和Gln殘基脫酰胺速率更易受到蛋白三級結構的變化的影響，特別是某些三級構象使Asn和Gln充分暴露促進了脫酰胺反應。Kossiakoff等[40]認為蛋白的三級結構是影響酰胺側鏈脫酰胺敏感性的主要原因。他利用中子散射特性研究胰島素酰胺基團(該蛋白中含有的天冬氨酰胺的多肽鏈，其附近的片段的氨基酸序列和構象具有顯著的多樣性)和脫酰胺過程中中子晶體結構，研究得出13個天冬氨酰胺殘基中的3個被改性，發生了脫酰胺反應，并且發現改性后的殘基和其他未改性的天冬氨酰胺殘基具有非常不同的局部構象和氫鍵結構，因此他指出胰島素脫酰胺的偏好性和側鏈基團脫酰胺位點之間沒有關聯性。

3 脫酰胺改性蛋白和肽的結構和聚集態的變化

脫酰胺改性過程中，蛋白一邊伸展也一邊發生一定程度交聯。蛋白分子聚集將改變蛋白分子質量、結構和分子柔性。特別是食物蛋白的功能特性與食物蛋白分子大小和結構特征緊密相關，分子質量合適且分子柔性好的食物蛋白的乳化穩定性和起泡穩定性更好[41]。因此，適度地伸展蛋白且保持一定聚集態(分子柔性、分子質量和分子構象)，更利于提高蛋白功能特性。有趣的是，與結構化學家(2.3節)認為三級結構更易影響蛋白或肽的脫酰胺速率的結論相悖，部分學者研究表明脫酰胺改性并不影響蛋白二硫鍵(表3)，進而不影響三級結構，但影響蛋白二級結構、熱特性和分子質量分布(表3)。也有研究報道[42]脫酰胺改性后，改性蛋白在常溫條件下存放也發生聚集現象。

表3 脫酰胺改性蛋白或肽結構和聚集態的研究Table 3 Conformation and aggregative behavior of proteins and peptides by deamidation

熱作用是蛋白脫酰胺過程中發生聚集三級結構改變的主要誘因[17,24,29]。Matsudomi等[43]詳細地研究了鹽酸脫酰胺改性卵清蛋白過程中的卵清蛋白聚集機制，提出在熱處理過程中，卵清蛋白首先通過疏水交互反應相互接近，再緩慢形成二硫鍵而形成可溶性聚集體，而在常溫空氣存放中，疏水鍵和二硫鍵使脫酰胺改性后的卵清蛋白發生聚集。并提出了一個簡單的反應模型表述卵清蛋白在鹽酸濕熱脫酰胺過程中蛋白分子的聚集行為。該反應模型強調了卵清蛋白分子是通過分子內二硫鍵和非共價鍵相互作用形成的分子網絡結構，達到一邊脫酰胺一邊展開分子構象而提高蛋白功能特性的目的。在Matsudomi等[43]提出的分子模型基礎上，本課題組針對有機酸脫酰胺改性小麥面筋蛋白分子的聚集行為提出了全新聚集態變化模型，認為小麥面筋蛋白在改性過程中，酸脫酰胺產生的分子靜電斥力和熱效應產生的聚集力相互博弈，麥谷蛋白與醇溶蛋白經歷了聚集、解離同時進行的過程[45]。但與表3李紅梅[26]、Chiu[41]等不同的是，有機酸濕熱處理脫酰胺會導致了小麥面筋蛋白發生聚集，分子內氫鍵和二硫鍵將發生重排，并認為蛋白不斷增大靜電斥力可能是導致蛋白聚集體粒徑、構象突變的主要原因[44]。

4 結 語

綜上所述，對于人體蛋白和肽，脫酰胺反應對蛋白反轉和細胞老化至關重要；而食物蛋白，不管是非酶脫酰胺還是酶脫酰胺，脫酰胺可高效地改性食物蛋白，得到特征功能特性改善的功能性蛋白。特別是本文綜述的脫酰胺改性條件，比如高溫和低pH值，在食品和農產品加工中普遍使用，因此食物蛋白在食品和農產品加工中發生脫酰胺反應不可避免。從本質上，了解蛋白或肽酰胺基團暴露途徑、暴露程度、催化劑作用位點的特點和作用效果、以及脫酰胺脫酰胺對蛋白結構和功能的決定條件和影響，對于深入研究蛋白或肽中酰胺基團的反應行為、進而尋找安全高效的脫酰胺改性食物蛋白和肽方法尤為重要。對于人體蛋白和肽，人工合成蛋白和肽應用于以在各種生物體系，進一步研究其作用機制和控制方法，將是未來該領域的發展趨勢。

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