醋蛋水解物的類蛋白反應(yīng)及其對(duì)ACE抑制活性的影響

楊 鋒，陳錦屏，莫錦薇

(1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2.廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西 柳州 545006)

醋蛋是流傳于民間的一項(xiàng)發(fā)明，以米醋為基質(zhì)，加入雞蛋浸泡而成。醋使蛋清中的蛋白分子降解，釋放出具有活性的蛋白寡肽及氨基酸[1]。研究表明醋蛋中的活性肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制作用，能降血壓[2-4]。ACE在血壓調(diào)節(jié)過程中具有重要的生理功能，可以催化血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，AngⅡ具有收縮血管平滑肌的效應(yīng)，可以導(dǎo)致血管收縮，引發(fā)高血壓。ACE抑制肽與AngⅠ的結(jié)構(gòu)相似，會(huì)一起競爭ACE的作用位點(diǎn)，兩者成為ACE的競爭性底物，從而阻止AngⅡ的生成，起到降低血壓的作用[5]。

類蛋白反應(yīng)，又稱蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，是通過酶的催化使?jié)饪s后的蛋白水解物形成一種黏稠狀物質(zhì)。通常分兩步反應(yīng)進(jìn)行，第一步反應(yīng)是在適宜條件下通過酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行限制性水解，得到多肽；第二步反應(yīng)是將濃縮后的水解物作為底物，加入氨基酸，在適宜條件下通過酶的催化生成觸變膠體或黏稠狀的液體[6]。類蛋白反應(yīng)可以用來脫除蛋白酶解物的苦味、產(chǎn)生令人愉快的風(fēng)味[7]，也可以用來提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值和功能性質(zhì)[8]，還可以用來改善一些水解物的生物活性，如改善酪蛋白水解物的ACE抑制活性和抗氧化活性[9-12]。目前，關(guān)于醋蛋水解物的類蛋白反應(yīng)研究還未見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)醋蛋水解物的類蛋白反應(yīng)及其對(duì)ACE抑制活性的影響作了初步研究，為醋蛋的進(jìn)一步開發(fā)利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雞蛋 市售。

9°米醋王 廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE) 美國Sigma公司；胃蛋白酶(來源于豬胃黏膜，酶活力1560U/mg)、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸 上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-2冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；WFZ UV-2000型紫外-可見分光光度計(jì) 廣州北銳精密儀器有限公司；PHS-3D精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 醋蛋水解物的制備

挑選大小均一的雞蛋，洗去表面污垢，再用體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭雞蛋表面，晾干后稱量，以醋蛋比3.0mL/g加入米醋于20～25℃密封浸泡36h，挑破蛋膜，用紗布過濾，得醋蛋液。醋蛋液中加入胃蛋白酶([E]/[S]=1/100)，于37℃條件下酶解5h，取出在沸水浴中滅酶5min，5000r/min離心15min得上清液，測定上清液中游離氨基含量[13]。上清液再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后經(jīng)冷凍干燥得醋蛋水解物，備用。

1.2.2 醋蛋水解物的類蛋白反應(yīng)

用胃蛋白酶對(duì)醋蛋水解物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)。固定胃蛋白酶的添加量為1g/100g底物蛋白質(zhì)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)氨基酸的選擇和其添加量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確定類蛋白反應(yīng)的適宜條件。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴中保溫10min滅酶，然后測定類蛋白產(chǎn)率和部分產(chǎn)物的ACE抑制活性。

1.2.3 類蛋白產(chǎn)率的測定

按照1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，同時(shí)以滅活的胃蛋白酶替代有活性的胃蛋白酶進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后，參照張雅麗等[14]的方法，計(jì)算類蛋白得率。具體方法如下：類蛋白反應(yīng)結(jié)束后，用10g/100mL的三氯乙酸(TCA)將反應(yīng)產(chǎn)物定容至100mL，吸取5mL稀釋樣液于離心管中，于10000r/min離心30min，用微量凱氏定氮儀分別測出上清液和沉淀物中的氮含量，按式(1)計(jì)算出類蛋白的產(chǎn)率。

1.2.4 ACE抑制活性的測定

參照Cushman等[15]建立的分光光度法，略作修改，測定產(chǎn)物的ACE抑制活性，具體操作步驟如下：吸取50μL抑制劑，加入100μL 5mmol/L馬尿酰組氨酰亮氨酸中，再加入100μL 1.0mol/L的NaCl-硼酸緩沖液(pH 8.3)，37℃恒溫水浴5min；立即加入50μL ACE啟動(dòng)反應(yīng)，37℃恒溫反應(yīng)30min后，加入0.5mL 1mol/L的HCl終止反應(yīng)；再加入1.5mL冷的乙酸乙酯，漩渦混合均勻后，4000r/min離心10min后取出1.0mL酯層轉(zhuǎn)入另一試管，充分烘干后，再將它重新溶于3.0mL去離子水中，在228nm波長處測定吸光度。按式(2)計(jì)算ACE抑制活性。

式中：Aa為不存在抑制劑時(shí)的吸光度；Ab為存在抑制劑與ACE時(shí)的吸光度；Ac為抑制劑與ACE都不存在時(shí)的吸光度。

IC50值表示能抑制50% ACE酶活力時(shí)的抑制劑質(zhì)量濃度，具體操作計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 類蛋白反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 氨基酸的選擇

ACE抑制肽結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究結(jié)果表明，C末端為色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和脯氨酸，而N末端為支鏈氨基酸的二肽或三肽具有強(qiáng)的ACE抑制活性[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸這4種氨基酸來參加醋蛋水解物的類蛋白反應(yīng)，以氨基酸添加量為1mol/mol水解物游離氨基、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、反應(yīng)pH5.0、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間24h的條件來進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，考察不同氨基酸對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)產(chǎn)物ACE抑制活性的影響，結(jié)果如圖1所示，添加氨基酸進(jìn)行類蛋白反應(yīng)后，產(chǎn)物的ACE抑制活性均有不同程度的變化。添加苯丙氨酸和色氨酸反應(yīng)后，產(chǎn)物的ACE抑制活性顯著降低(P＜0.05)，其原因可能是苯丙氨酸和色氨酸未結(jié)合到C末端，而結(jié)合到N末端。添加酪氨酸和脯氨酸反應(yīng)后，產(chǎn)物的ACE抑制活性顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，其中添加脯氨酸反應(yīng)后活性增加的更多。另外還有資料報(bào)道[11]，如果C末端三肽序列中含有一個(gè)脯氨酸，活性將明顯增強(qiáng)。因此選擇脯氨酸來修飾所制備的醋蛋水解物，進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)其ACE抑制活性。

圖 1 不同氨基酸對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of amino acid type on plastein reaction of vinegar egg hydrolysates

2.1.2 脯氨酸的添加量選擇

選取脯氨酸添加量分別為0.5、1、1.5、2mol/mol水解物游離氨基，以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、反應(yīng)pH 5.0、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間24h的條件來進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，考察脯氨酸的添加量對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示，脯氨酸的添加量不同會(huì)對(duì)類蛋白產(chǎn)率有一定的影響，當(dāng)脯氨酸添加量小于1mol/mol水解物游離氨基時(shí)，類蛋白產(chǎn)率隨著添加量的增加而顯著增加(P＜0.05)，當(dāng)添加量增加到1mol/mol水解物游離氨基時(shí)，類蛋白產(chǎn)率達(dá)到最大，而添加量繼續(xù)增加時(shí)，類蛋白產(chǎn)率變化不顯著(P＞0.05)。因此選擇脯氨酸的添加量為1mol/mol水解物游離氨基。

圖 2 脯氨酸的添加量對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of proline concentratrion on plastein reaction of vinegar egg hydrolysates

2.1.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

據(jù)資料報(bào)道[18]，合成類蛋白反應(yīng)的底物最好是通過蛋白酶水解的低分子量肽混合物，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大小是影響類蛋白反應(yīng)的重要因素，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于7.5%時(shí)，發(fā)生的將不是類蛋白反應(yīng)，而是水解反應(yīng)，只有當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)足夠高時(shí)，類蛋白反應(yīng)才會(huì)發(fā)生。選取底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%，以脯氨酸添加量1mol/mol水解物游離氨基、反應(yīng)pH 5.0、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間24h的條件來進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～50%時(shí)，類蛋白產(chǎn)率隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而顯著增大(P＜0.05)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)超過50%后，類蛋白產(chǎn)率的變化不顯著(P＞0.05)，因此選擇適宜的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。

圖 3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on plastein reaction of vinegar egg hydrolysates

2.1.4 反應(yīng)pH值的選擇

對(duì)于同一種酶來說，參加類蛋白反應(yīng)和參加酶水解反應(yīng)的最佳pH值范圍往往是不同的[19]。另外，還有資料[18]表明，在酶水解過程中，不同的酶其最適pH值不同，而在類蛋白反應(yīng)中卻發(fā)現(xiàn)不管采用哪種酶，其最有效作用pH值都在4.0～7.0范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中選擇pH3.0～7.0，以脯氨酸添加量1mol/mol水解物游離氨基、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、反應(yīng)溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間24h的條件來進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，考察反應(yīng)pH值對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，在pH5.0時(shí)，類蛋白產(chǎn)率最高，因此從類蛋白產(chǎn)率考慮，選擇反應(yīng)pH值為5.0，這與胃蛋白酶參加酶水解反應(yīng)的最適pH值為2～3有所不同[20]。

圖 4 反應(yīng)pH值對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of pH on plastein reaction of vinegar egg hydrolysates

2.1.5 反應(yīng)溫度的選擇

類蛋白反應(yīng)溫度與蛋白酶的最適溫度相關(guān)，有研究[21]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度在50℃以前，類蛋白形成的初始速率和產(chǎn)量隨著溫度增加而增加，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，盡管反應(yīng)的最初速率比較快，但反應(yīng)很快停止，其最終產(chǎn)量不高。選取反應(yīng)溫度37～60℃，以脯氨酸添加量1mol/mol水解物游離氨基、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、反應(yīng)pH5.0、反應(yīng)時(shí)間24h的條件來進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，考察反應(yīng)溫度對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響。由圖5可知，在反應(yīng)溫度50℃以下，隨著反應(yīng)溫度的升高，類蛋白產(chǎn)率逐漸增加，但是差異不顯著(P＞0.05)。當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，類蛋白產(chǎn)率顯著下降(P＜0.05)。因此從節(jié)能方面考慮，選擇反應(yīng)溫度為37℃。

圖 5 反應(yīng)溫度對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of temperature on plastein reaction of vinegar egg hydrolysates

2.1.6 反應(yīng)時(shí)間的選擇

以脯氨酸添加量1mol/mol水解物游離氨基、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、反應(yīng)pH5.0、反應(yīng)溫度37℃的條件來進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響。由圖6可知，在反應(yīng)12h內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，類蛋白產(chǎn)率顯著增加(P＜0.05)，當(dāng)反應(yīng)12h后，類蛋白產(chǎn)率變化不顯著(P＞0.05)。

圖 6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)醋蛋水解物類蛋白反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of reaction time on plastein reaction of vinegar-egg hydrolysates

2.2 類蛋白反應(yīng)對(duì)醋蛋活性肽ACE抑制活性的影響

在上述優(yōu)化的條件下，即脯氨酸添加量1mol/mol水解物游離氨基、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、反應(yīng)pH5.0、反應(yīng)溫度37℃進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，通過控制不同的反應(yīng)時(shí)間，制備5個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物，其ACE抑制活性的變化如表1所示。

表 1 類蛋白反應(yīng)對(duì)醋蛋水解物ACE抑制活性的影響Table 1 Effect of plastein reaction on ACE inhibitory activity of vinegar egg hydrolysates

由表1可知，類蛋白反應(yīng)對(duì)醋蛋水解物的ACE抑制活性有影響，與未進(jìn)行類蛋白反應(yīng)的醋蛋水解物相比，在反應(yīng)6h內(nèi)，其ACE抑制活性先降低后升高，在反應(yīng)6～12h之間，其ACE抑制活性顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，在反應(yīng)進(jìn)行到12h時(shí)， ACE抑制活性最高，其IC50值從反應(yīng)前的0.48mg/mL降低到0.17mg/mL，這表明類蛋白反應(yīng)可以提高醋蛋水解物的ACE抑制活性，但是活性的變化和類蛋白反應(yīng)程度之間無明顯的相關(guān)性。這與朱曉杰等[22]的研究結(jié)果相似，他在研究海地瓜蛋白酶解物類蛋白反應(yīng)修飾及對(duì)ACE抑制活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物ACE抑制活性的提高與反應(yīng)程度的相關(guān)性不大，他認(rèn)為這是類蛋白合成的隨機(jī)性決定的。李亞云等[12]在研究脯氨酸存在下酪蛋白ACE抑制肽的類蛋白反應(yīng)修飾時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)酪蛋白ACE抑制肽經(jīng)過不同程度的類蛋白反應(yīng)修飾后其ACE抑制活性出現(xiàn)不規(guī)則的變化，他認(rèn)為可能與反應(yīng)過程中脯氨酸和ACE抑制肽的結(jié)合方式(C末端和N末端)有關(guān)，若脯氨酸結(jié)合在C末端，其活性將明顯增強(qiáng)，若結(jié)合在N末端，其活性反而降低。因此，可以推測，醋蛋水解物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)時(shí)，脯氨酸可能優(yōu)先結(jié)合在N末端，導(dǎo)致其ACE抑制活性降低，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，結(jié)合在C末端的脯氨酸逐漸增多，使得其ACE抑制活性逐漸增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

3.1 用胃蛋白酶對(duì)醋蛋水解物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)，得到優(yōu)化工藝條件為：氨基酸選用脯氨酸、脯氨酸添加量為1mol/mol水解物游離氨基、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、反應(yīng)溫度37℃、pH 5.0、反應(yīng)時(shí)間12h，在此條件下，類蛋白產(chǎn)率為25.82%。

3.2 經(jīng)過類蛋白反應(yīng)，醋蛋水解物的ACE抑制活性有所改善，但是活性的變化與類蛋白反應(yīng)程度無明顯相關(guān)性。反應(yīng)6h后，產(chǎn)物的活性較反應(yīng)前明顯增強(qiáng)，反應(yīng)達(dá)到12h時(shí)，產(chǎn)物的ACE抑制活性最高，其IC50值從反應(yīng)前的0.48mg/mL降低到0.17mg/mL。

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