黑曲霉H1-9b發酵產葡萄糖氧化酶的工藝優化

唐 菁，趙 芯，蘇 茉，唐云明*

(西南大學生命科學學院，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一種需氧脫氫酶，它能利用分子氧作為電子受體，專一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫[1]。這種酶廣泛應用于工業、食品加工、釀酒[2]及醫藥衛生行業[3-5]。葡萄糖氧化酶在工業生產中多以黑曲霉(Aspergillus niger)、點青霉 (Penicilliun notatun)等微生物為主要來源[6]。表面活性劑具有乳化和分散的作用，在發酵過程中可以改善氣液表面的狀態以及發酵液流動性的功能，也具有改變細胞膜通透性的功能。本實驗篩選獲得一株葡萄糖氧化酶的高產菌株，黑曲霉H1-9b(20U/mL)，與Petruccioli等[7]研究得出的5.49U/mL和Khattab等[8]測得的最大酶活力15.9U/mL相比，該菌株在產酶能力上有較大優勢。本實驗以黑曲霉H1-9b為出發菌株，采用單因素和正交設計優化發酵條件，并通過向培養基中添加表面活性劑，提高單位體積發酵液的葡萄糖氧化酶產量，以期為工業化生產提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌種為本實驗室分離保藏的菌株黑曲霉H1-9b[9]。

1.2 培養基

斜面培養基：察氏(Czapek)培養基[10]；發酵培養基：采用本實驗室優化后的培養基，即含葡萄糖80g/L、蛋白胨2g/L、NaNO35g/L、KH2PO40.7g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L，pH值自然。

1.3 方法

1.3.1 培養

活化培養：挑1環孢子接種于斜面培養基上，28℃培養箱中培養96h。

孢子懸液制備：取活化的斜面培養的1支，加入無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，采用血細胞計數法調整孢子濃度為106個/mL。

發酵培養：250mL的三角瓶中裝入50mL的發酵培養基，于28℃搖床上200r/min振蕩培養78h。

1.3.2 粗酶液制備

1.3.2.1 菌絲體粗酶液制備

搖床發酵培養完成后，用紗布過濾發酵液，收集球狀菌絲體，用雙蒸水將其反復沖洗，直至把發酵液沖洗干凈；再用0.2mol/L pH5.7的磷酸緩沖液沖洗菌絲體，壓干水分，稱質量。將菌絲體置于研缽中，加入適量石英砂，對菌體進行研磨；充分研磨后按1：1(m/V)加入預冷的0.05mol/L pH5.7的磷酸緩沖液浸酶，4℃抽提2h。抽提完成后在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清，于4℃保存。

1.3.2.2 發酵液粗酶液制備

發酵液先用兩層紗布過濾，濾液冷凍離心，條件為4℃、10000r/min離心15min，取上清，于4℃保存。

1.3.3 酶活力測定參照文獻[4,11]的方法并加以改進，取適當稀釋后酶液50μL，加入2.0mL 0.1mol/L pH5.7的磷酸緩沖溶液、0.3mL 10%葡萄糖溶液、50μL 16mmol/L 4-氨基安替吡啉、50μL 7.5mmol/L苯酚、50μL 1000U/mL的過氧化物酶，在37℃條件下，準確反應4min，再置于沸水浴中快速滅活4min，冷卻至室溫，在500nm波長處測定其吸光度；用預先滅活的酶液作空白對照，其他處理條件相同。酶活力單位(U)定義為：每分鐘消耗1μmol葡萄糖所需要的酶量為1個活力單位。

1.3.4 蛋白質的含量

采用紫外分光光度法[12]測定蛋白質含量。

1.3.5 菌體干質量測定[13]

將經兩層紗布過濾后的菌絲體，用蒸餾水沖洗2次，于55℃烘箱中干燥至質量恒定后稱質量。

1.3.6 不同發酵條件對產酶的影響[14]

1.3.6.1 轉速對產酶的影響

以發酵培養基為基礎，裝液量為250mL三角瓶中發酵液50mL，接種200μL孢子懸液，搖床轉速設定為1～4組，分別為150、200、250、300r/min，28℃振蕩培養78h。每組處理設3個重復。

1.3.6.2 初始pH值對產酶的影響

用0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的NaOH溶液調節，使發酵液初始pH值為3～8，0.5為1個pH值間隔，各組pH值重復3次。搖床轉速為250r/min，28℃振蕩培養78h。

1.3.6.3 接種量對產酶的影響

以發酵培養基為基礎，接種量設定為10、50、100、150、200、250、300μL孢子懸液，每組水平重復3次。初始pH4.5，裝液量為250mL三角瓶中發酵液50mL，搖床轉速為250r/min，28℃振蕩培養78h。

1.3.6.4 裝液量對產酶的影響

設定250mL三角瓶中所含的發酵液為20、40、50、60、80、100、120、140mL，每組水平重復3次。接種量為250μL孢子懸液，搖床轉速為250r/min，28℃振蕩培養78h。

1.3.6.5 表面活性劑對產酶的影響

向基礎發酵培養基中分別添加0.5%的吐溫-20、吐溫-80和Triton X-100來考察表面活性劑種類對產酶的影響。搖床轉速為250r/min，28℃振蕩培養78h。

1.4 數據處理

采用SPSS 11.5軟件進行數據處理，參考文獻[15]的方法。

2 結果與分析

2.1 發酵條件的優化研究

2.1.1 轉速對產酶的影響

黑曲霉為專性好氧菌，孢子的萌發、菌體的繁殖和酶的合成都需要氧氣。三角瓶中的發酵液在搖床上振蕩，產生氣液的混合和分散，使空氣中的氧有效地溶解。因此，搖床轉數影響菌體的生產和酶的產量。由圖1可知，最適轉速為200r/min。若轉速低于200r/min，由于通氧差，產酶量降低；隨著轉速的增加，剪切力增大而影響菌體生長，產酶量也隨之下降。

圖 1 轉速對產酶的影響Fig.1 Effect of rotation speed on glucose oxidase production

2.1.2 初始pH值對產酶的影響

圖 2 初始pH值對產酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on glucose oxidase production

初始pH值會影響菌的代謝途徑和生長速率[16]，從而影響菌的生長和酶的合成。黑曲霉在pH1.5～9.0的范圍內都能生長[17]。由圖2可知，黑曲霉H1-9b在初始pH值為3～8的范圍內都能生長，最適pH值為4.5。當初始pH＞7時，黑曲霉H1-9b基本貼壁生長；當初始pH＜4.5時，這由于菌代謝產酸，進一步降低發酵液pH值，影響跨膜pH值梯度，引起菌體膜滲透性的變化，從而影響菌對養分的吸收和代謝產物的分泌，導致產酶量不高。

2.1.3 接種量對產酶的影響

圖 3 接種量對產酶的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on glucose oxidase production

接種量影響菌生長達到高峰的時間，從而影響產物的合成。由圖3可知，接種量為250μL時，其酶活力最高。接種量＜100μL時產酶量較低，可能原因是菌絲體生長過慢，需要較長的發酵時間才能達到最大菌絲生物量，從而影響了產酶量；接種量＞250μL時，產酶量也隨之降低，可能是由于菌體生長過快，發酵液黏度增加，導致溶氧不足，影響葡萄糖氧化酶的合成。

2.1.4 裝液量對產酶的影響

裝液量的多少直接影響溶氧水平，從而影響菌生長和產酶。由圖4可知，當裝液量為80、100、120mL時，酶活力較高。當裝液量為140mL時，酶活力降低，這主要是因為隨著裝液量的增加，體積溶氧系數降低，導致黑曲霉生長所必需的氧供應不足，從而導致產酶量降低。

圖 4 裝液量對產酶的影響Fig.4 Effect of broth amount on glucose oxidase production

2.1.5 正交試驗[18]優化發酵工藝

選用L9(34)設計正交試驗，對接種量、裝液量、初始pH值以及轉速這4個因素進行優化，見表1，初始pH值是影響搖瓶發酵生產葡萄糖氧化酶的最主要因素，而影響搖瓶發酵的最小因素為接種量。A1B2C2D1為最佳組合，即轉速200r/min、初始pH5.3、接種量200μL孢子懸液、裝液量80mL。

表 1 正交試驗設計及結果Table 1 Design and results of orthogonal tests

2.2 表面活性劑對產酶的影響

2.2.1 表面活性劑種類對產酶的影響

表面活性劑一方面具有改善細胞膜通透性，減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，加快物質傳遞運輸的能力；另一方面對微生物有毒性和殺菌作用[19]。黑曲霉H1-9b產的葡萄糖氧化酶為胞內酶，考慮通過添加表面活性劑促使酶釋放，從而提高發酵液中葡萄糖氧化酶的含量，達到提高總酶活力的目的。由圖5可知，3種表面活性劑對產酶都有促進作用，其中吐溫-80對產酶的促進作用最強。因此選用吐溫-80作進一步研究。

圖 5 表面活性劑對產酶的影響Fig.5 Effect of surfactant type on glucose oxidase production

2.2.2 吐溫-80添加量對產酶的影響

由圖6可知，吐溫-80添加量為0時，酶活力為28.60U/mL；隨著吐溫-80添加量的增高，產酶的促進效果也增強；當添加量為3%時，酶活力達到68.96U/mL，約提高了1.4倍。可能原因是添加量達到3%之前，細胞膜和細胞壁的通透性隨著添加量的增高而逐漸增大，在3%附近，菌體產酶達到最大值。添加量繼續增大，過大的細胞膜和細胞壁通透性會影響菌體細胞的正常生命活動。因此，選擇吐溫-80添加量為3%。

2.3 發酵時間對產酶的影響

圖 7 黑曲霉H1-9b的產酶曲線Fig.7 Production curve of glucose oxidase

由圖7可知，黑曲霉H1-9b在培養3d時，達到產酶高峰，之后酶活力緩慢下降，因此發酵時間應為3d左右。

3 討 論

影響黑曲霉產葡萄糖氧化酶的因素很多，在液體發酵狀態下培養基的組成、發酵條件等都是重要因素。本實驗室已經研究不同發酵培養基對黑曲霉H1-9b的產酶影響(未發表)；在此基礎上，本研究對發酵條件進行了正交試驗優化；之后向培養基添加3%吐溫-80以提高葡萄糖氧化酶產量。優化后的發酵條件為：接種量200μL孢子懸液、裝液量80mL、初始pH5.3、轉速200r/min。這時所獲得的葡萄糖氧化酶總酶活力最高可達28.60U/mL；當在培養基中添加3%吐溫-80后，酶活力提高到68.96U/mL，是未添加吐溫-80發酵產酶量28.60U/mL的2.4倍，是文獻[8]報道的4倍。通過發酵動力學曲線得知，黑曲霉H1-9b的發酵時間應為3d左右。

本研究通過添加表面活性劑吐溫-80[20]的方法，顯著提高了酶產量。這對小規模發酵生產更多的酶有一定的參考價值。使用吐溫-80具有以下優點：屬于非離子表面活性劑，對菌體的毒性最小；是水溶性長鏈脂肪酸的酯類物質，可影響微生物細胞的膜通透性[20]及發酵液的乳化性和分散性，使葡萄糖氧化酶釋放到發酵液中；分泌到胞外的葡萄糖氧化酶更適合于工業化大生產和獲得高純度樣品，因為胞外酶收集方便，發酵液中蛋白質種類較細胞內部少，從而可以降低后續純化難度，故可考慮將此方法應用于小規模工業化生產，同時也為今后研究大規模發酵生產工藝提供一定的參考。

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