雞骨渣中蛋白質的酶解應用效果研究

李苗云，趙改名,*，許 雄，王玉芬，謝 華，柳艷霞，田 瑋

(1.河南農業大學食品科學技術學院，河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.雙匯集團技術中心，河南 漯河 462000)

我國是世界雞肉生產、消費和貿易大國，2009年雞肉產量約1210萬t，雞骨約占胴體質量的10%～30%，年產鮮雞骨約2000萬t，但用于深加工的雞骨不足總量的2%[1]。雞骨通過骨肉分離機獲取其上面殘留的鮮肉，而排出的廢渣俗稱骨渣，價格更是低廉，而雞骨渣中含有豐富的蛋白質(13%～15%)和生物活性物質，有極大的潛在應用價值[2]。

近年來，酶解技術在食品副產物綜合利用方面得到了廣泛研究與應用，具有反應溫度低、時間短、無環境污染以及營養價值高等優點[3-5]。骨的利用主要集中在酶解提取營養物質[6-8]，軟骨中的硫酸軟骨素提取[9-10]等，主要是骨肉原料高溫高壓蒸煮后酶解，投入的成本較高。而雞骨渣的顆粒感給生產帶來的不便以及雞骨本身帶有的腥味[11]，使很多企業難以消化大量成本低廉的雞骨渣。將骨蛋白直接進行酶解處理后，營養價值較高，可以制備功能性肉類提取物或開發高附加值的調味料，提高其利用價值[12]，而目前雞骨渣酶解后的應用研究很少，限制了骨渣的利用。因此，如何有效的加強新鮮雞骨渣的合理加工和綜合利用是亟待解決的重要問題之一。

本實驗通過確定不同蛋白酶水解雞骨渣的最適溫度，研究其水解產物的氨基酸組成和以酶解濃縮液為原料生產雞肉香精的效果，確定適用于深度加工雞骨渣的蛋白酶類，提高雞骨渣附加值，對于企業的可持續發展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞骨渣、雞骨油、水解植物蛋白液、酵母抽提物、谷氨酸、半胱氨酸、葡萄糖、木糖、VB1、呋喃酮、甲硫氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽-水合物、味精、I+G 漯河雙匯生物工程公司。

1.2 試劑與儀器

復合蛋白酶(1.5AU/g)、中性蛋白酶(1.5AU/g)、堿性蛋白酶(2.5AU/g)(1AU為1min水解變性血紅蛋白產生1mmol酪氨酸的酶量) 丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶(6.0×105U/g) 比利時PSM有限公司；其余試劑均為國產分析純試劑。

3205型食品加工機(調理機) 匈牙利博朗電器公司；YXQGOI型蒸汽消毒器 山東新華醫療器械廠；1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞骨渣的酶解與小試處理

在查閱文獻[13-14]和前期研究[15]基礎上選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶的最佳酶解條件進行雞骨渣的酶解效果研究。木瓜蛋白酶：溫度65℃、加酶量0.10%、反應時間1.8h、自然pH值和料液比1：1(m/V)；堿性蛋白酶：溫度60℃、加酶量0.12%、反應時間2.5h、自然pH值和料液比1：1；中性蛋白酶：溫度58℃、加酶量0.20%、反應時間2.2h、自然pH值和料液比1：1；復合蛋白酶：溫度60℃、加酶量0.20%、反應時間2h、自然pH值和料液比1：1。

取混勻后新鮮雞骨樣品50g(精確至0.01g)，放入250mL三角瓶中，加入一定量的水，分別加入上述4種蛋白酶，在其最適宜的酶解條件下，置于水浴恒溫振蕩器中進行水解。水解完畢，于90℃滅酶15min，之后將樣品水洗沖渣過濾，一并轉入250mL容量瓶中，定容。測定殘渣量、水解度和總氮回收率以驗證酶解效果。同時進行40kg級中試，測定殘渣量與小試進行對比。

1.3.2 40kg級酶解雞骨渣的中試處理

在某公司原料庫，同批同質隨機取新鮮雞骨，充分混勻后，加入一定量的水，分別選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶在各自最佳的酶解溫度和時間進行酶解。酶解后于90℃、15min滅酶，之后將樣品水洗沖渣過濾，將剩余的殘渣于25℃，自然晾干2h。分別測定雞骨渣酶解后的殘渣量、雞骨渣酶解液中氨基酸含量以及制備雞肉香精。

1.3.3 雞骨渣酶解液氨基酸的測定

取中試處理的酶解液，用高效液相色譜測定游離氨基酸含量。準確稱取樣品5g(精確到0.0001g)，加去離子水15mL，加10%的磺基水楊酸20mL，攪勻放置24h，中速濾紙過濾后，用4mol/L的NaOH調整pH值至6.0，定容至50mL的容量瓶，取1mL經過孔徑0.45μm濾膜除去大分子。移取10μL樣品于小試管底部，將小試管置于真空瓶中，待試管內液體抽干，向小試管內加20μL衍生緩沖溶液，渦旋10s后，再加入20μL衍生試劑溶液，渦旋振蕩10s，60℃避光反應60min后冷卻，再加入160μL平衡緩沖液，渦旋振蕩20s后轉移到樣品瓶。待測。

色譜分析條件：色譜柱：Elite-AAK氨基酸分析專用柱；洗脫速率1mL/min；進樣體積l0μL；紫外檢測器檢測波長360nm；柱溫23℃；洗脫時間48min；洗脫液A為乙腈、水體積比1：1；洗脫液B為1份流動相B溶液+9份經過孔徑0.45μm濾膜過濾處理的高純水。梯度洗脫變化如表1所示。

表 1 梯度洗脫變化Table 1 Changes of gradient elution

1.3.4 熱反應雞肉香精的制備

表 2 雞肉香精反應配方Table 2 The reaction ingredients of chicken flavors

選擇不同蛋白酶中試處理的酶解液，經蒸發濃縮后制得酶解濃縮液，以酶解濃縮液(HAP)為基料(可溶性固形物含量為40°Brix)，按照表2的配方取樣，再加入味精、I+G和適量的水，于自然pH值條件下充分搖晃使其混合均勻后置于高壓蒸汽消毒器中，115℃反應2h，然后在流動水中快速冷卻，待冷至室溫后制得雞肉香精，盛裝于細口瓶中密閉保存1d后進行感官評定。

1.3.5 殘渣量的測定

殘渣量指酶解后剩余殘渣的質量占酶解雞骨渣樣品質量的百分比，該指標在一定程度上反映了骨肉分離的效果。酶解后，將剩余的殘渣于25℃，自然晾干2h除去水分后稱質量，即為殘渣的質量。

1.3.6 水解度的測定

根據Alder-Nissen[16]的計算方法測定水解度(DH)。

1.3.7 總氮回收率的測定

取經充分混勻的酶解液5mL，于水浴揮干后，采用按ISO 937—1978(E)《肉和肉制品的氮含量測定(參考方法)方法》進行。

1.3.8 熱反應雞肉香精產物的感官評定方法

將聞香紙浸入產物1～2cm，由7名評香員聞香，同時按甜香、肉香、脂香、焦糊味、腥味、硫臭味香氣的強度進行打分[17]，極弱1分，弱2分，適中4分，較強5分，很強7分。指標的權重分別為1、1.5、1、－0.25、－0.25、－0.5。

1.4 數據處理

采用SPSS 15.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 雞骨渣的酶解效果

應用4種蛋白酶的最佳酶解條件進行小試和40kg中試的酶解效果見表3。

表 3 不同蛋白酶的酶解效果Table 3 Hydrolysis efficiency of different proteases

4種蛋白酶在各自最佳酶解條件下的水解度以木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶較高，分別為14.68%和14.24%，木瓜蛋白酶總氮回收率最高，達71.68%，小試時的殘渣量以木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶較低，分別為24.60%和28.40%；小試和中試后的殘渣量均以木瓜蛋白酶最低，分別為24.60%和26.37%，且4種酶中試后的效果與小試基本一致。木瓜蛋白酶酶解后產品的脫肉效果最好，骨肉分離很干凈，殘渣量最低；而中性蛋白酶由于酶解后的雞骨渣上還有較多可見的碎肉，殘渣量最高，不適合單獨用于酶解脫肉處理；復合蛋白酶經中試實驗，產品殘渣量在30.36%，骨肉分離較干凈，但與木瓜蛋白酶相比，效果略差。

2.2 雞骨渣酶解液中氨基酸測定結果

表 4 不同酶解液的主要游離氨基酸含量Table 4 FAA contents in different HAPs mg/g

從表4雞骨渣不同蛋白酶酶解液中氨基酸的分析結果可以看出，水解液中的游離氨基酸含量較為豐富，人體所必需的8種氨基酸中，除色氨酸未檢出外，其他7種必需氨基酸，即蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的含量均較高。

在4種酶解液中，氨基酸總量差異顯著(P＜0.05)，必需氨基酸占氨基酸總量的比例(EAA/TAA)較高，除堿性蛋白酶酶解液較低(P＜0.05)外，其他3種蛋白酶酶解液的EAA/TAA均在45%左右。木瓜蛋白酶酶解液中的EAA和TAA含量最高，分別為6.505mg/g和14.965mg/g。各種酶解液中普遍含量較高的氨基酸有天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸，共占氨基酸總量的55%左右。木瓜蛋白酶酶解液中谷氨酸和丙氨酸含量最高，分別為1.951mg/g和1.601mg/g。中性蛋白酶酶解液纈氨酸、苯丙氨酸含量最低且必需氨基酸含量顯著低于其他3種酶解液(P＜0.05)；堿性蛋白酶酶解液中賴氨酸含量最低；中性蛋白酶酶解液中氨基酸總量最低。

2.3 熱反應雞肉香精感官評定結果

取經濃縮后的4種酶解液，按表2的配方于115℃反應2h，感官評價結果見表5，直觀圖見圖1。

表 5 不同酶解液制備雞肉香精的感官評價結果Table 5 Evaluation of chicken flavors prepared with different HAPs

圖 1 不同酶解液制備雞肉香精的風味圖Fig.1 Flavor plot of chicken fl avors prepared with different HAPs

由表5和圖1可知，不同蛋白酶酶解液制備的雞肉香精的風味有顯著差異(P＜0.05)。中性蛋白酶酶解液制備的香味料，肉香一般，較清淡，但是甜香明顯，且不良氣味較少，香氣整體柔和，圓潤。木瓜蛋白酶酶解液制備的香精，整體肉香突出，有良好的雞脂風味，其總體上最易讓人接受。堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解液制備的香味料的焦糊味與硫臭味較重，均與其他三者有明顯差異(P＜0.05)。

3 討 論

雞骨渣是雞骨架經過骨肉分離機后的副產物，低價低質，經4種蛋白酶酶解后，酶解液中氨基酸的含量豐富，為酶解液的應用提供了很好的條件[16]。堿性蛋白酶水解液中苦味最強的氨基酸較多，如精氨酸含量顯著高于其他3種酶解液(P＜0.05)，且纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、亮氨酸及異亮氨酸的含量相當豐富。中性蛋白酶酶解液中游離氨基酸的含量不高，但與糖反應能生產甜味的氨基酸占總游離氨基酸的量卻比較高[18]，這可能是中性蛋白酶酶解液制備的香精甜味較突出的原因。木瓜蛋白酶酶解液中谷氨酸和天冬氨酸等具有鮮味的氨基酸以及甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等具有甜味的氨基酸含量豐富，這與前人的研究[8,12]結果相似，為其應用奠定了基礎。在本研究中，以木瓜蛋白酶酶解液制備的香精，整體肉香突出，有良好的雞脂風味，酶解效果最好，這與前人研究[13,19-20]木瓜蛋白酶水解雞肉蛋白質的效果相似，與酶解液中的營養物質含量豐富有關。木瓜蛋白酶酶解雞骨渣后的殘渣量低，效果好，與其適應性強有關[13-14]。就4種蛋白酶價格相比，木瓜蛋白酶較低。因此，木瓜蛋白酶適合酶解雞骨渣，對雞骨渣的處理方式簡單、方便，對設備的投入少，價格較低，為雞骨渣的綜合利用提供了新的突破口。

4 結 論

木瓜蛋白酶在最適酶解溫度65℃、加酶量0.1%、反應時間1.8h、自然pH值和料液比1：1的條件下，酶解雞骨渣后的殘渣量最低，以其酶解液制備的香精，整體肉香突出，有良好的雞脂風味，適合用于深度開發雞骨渣。

[1] 趙電波, 陳茜, 白艷紅, 等. 動物屠宰副產物： 骨的開發利用現狀[J]. 肉類研究, 2010, 24(1)： 37-40.

[2] ARIHARA K, OHATA M. Bioactive compounds in meat[M]// TOLDRA F. Meat biotechnology. New York： Springer, 2008： 231-249.

[3] 肖志剛, 申德超, 吳謀成, 等. 擠壓法生產淀粉糖漿副產物酶解條件[J]. 農業工程學報, 2008, 24(9)： 288-293.

[4] BACK H H, CADWALLADER K R. Enzymatic hydrolysis of crayfi sh processing by-products[J]. Journal of Food Science, 1995, 5： 929-935.

[5] CHAMBERS J, RASMUSSEN P B. Enzymic treatment of bones[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1988, 42： 87-94.

[6] NIKOLAEV I V, STEPANOVA E V, EREMEEV N L, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of animal raw material for obtaining functional meat protein preparation[J]. Biotechnology (Moscow), 2008, 5： 59-67.

[7] ADLER-NISSEN J. Limited enzymatic degradation of proteins：a now approach in the industrial application of hydrolases[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 1982, 32： 138-156.

[8] MICHEL L, JACQUES F, MICHEL P, et al. Protein recovery from veal bones by enzymatic hydrolysis[J]. Journal of Food Science, 1995, 60(5)： 949-958.

[9] 吳楓楠. 堿-酶法提取硫酸軟骨素的工藝研究[J]. 食品與生物技術學報, 2010, 29(1)： 81-83.

[10] 趙培城, 高紅林, 朱順達. 豬硫酸軟骨素提取工藝研究[J]. 食品科學, 2004, 25(4)： 14-17.

[11] POPOV V O, DOSSENA A, NIKOLAEV I V, et al. Biocatalytic approach for poultry meat and bone residues conversion[J]. Journal of Biotechnology, 2010, 150(Suppl 1)： 570.

[12] MICHEL L, ROZAN P. Nutritional value of veal bone hydrolysate[J]. Journal of Food Science, 1997, 62(1)： 183-187.

[13] 謝永洪, 劉學文, 王文賢, 等. 雞肉蛋白酶水解工藝條件的研究[J]. 農業工程學報, 2004, 20(5)： 207-210.

[14] 趙謀明, 周雪松, 林偉鋒, 等. 雞肉蛋白熱處理與酶解特性的關系研究[J]. 農業工程學報, 2006, 22(6)： 169-172.

[15] 許雄, 柳艷霞, 趙改名, 等. 骨肉酶解工藝條件研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9)： 281-284.

[16] ADLER-NISSEN J. Enzymatic hydrolysis of food proteins[M]. London： Elsevier Applied Science Publishers, 1986.

[17] 歐陽杰, 武彥文. 肉類香精的感官評價[J]. 香料香精化妝品, 2003, 12(6)： 32-35.

[18] MOTTRAM D S. Flavour formation in meat and meat products： a review[J]. Food Chemistry, 1998, 62(4)： 415-424.

[19] DAMRONGSAKKUL S, RATANATHAMMAPAN K, KOMOLPIS K, et al. Enzymatic hydrolysis of raw hide using papain and neutrase[J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2008, 14(2)： 202-206.

[20] LIU Jianhua, TIAN Yinggang, WANG Yong, et al. Characterization and in vitro antioxidation of papain hydrolysate from black-bone silky fowl (Gallus gallus domesticus Brisson) muscle and its fractions[J]. Food Research International, 2011, 44： 133-138.