花生ACE抑制肽結構表征與構效關系

王 強，王春艷,2，胡 暉，劉紅芝，劉 麗

(1.中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193；2.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

花生中蛋白質含量高達26%～32%，是世界第三大蛋白質來源。花生蛋白含有人體必需的8種氨基酸中，除蛋氨酸含量較低外，賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸含量均接近聯合國糧農組織所規定的標準[1]，屬于完全蛋白。花生蛋白經復合酶水解后，可制備出具有抑制血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)活性的花生短肽。花生蛋白質酶解后粗產物一般是由蛋白質、肽和氨基酸組成的混合物，可利用各種分離技術對其進行分離純化而獲得高活性組分。功能性短肽的化學結構與其特定的生物活性存在密切聯系，肽分子鏈中氨基酸的組成、序列及分子構象信息對其生物活性有著重要的影響。

在高活性花生短肽組分篩選與結構表征方面，柳杰[2]通過發酵法制備了花生抗氧化肽，利用凝膠過濾、半制備RP-HPLC分離純化出4個組分，并確定了高抗氧化活性組分。Su等[3]利用微生物發酵法制備了花生短肽，經RP-HPLC純化篩選出風味肽，并表征了其氨基酸序列。在ACE抑制活性短肽構效關系研究方面，Zaliani等[4]運用主成分分析方法從36個參數中篩選出分子的立體與電性等特征參數，并對其ACE抑制活性進行了研究。劉煥等[5]從肽鏈的一級結構出發，以分子電邊矢量為參數，36種血管緊張素轉化酶二肽抑制劑為樣本，構建了血管緊張素轉化酶二肽抑制劑的構效關系模型。

綜上可見，相關研究多為高抗氧化活性花生短肽組分篩選，而高ACE抑制活性花生短肽組分分離純化與結構表征卻鮮有報道，且短肽構效關系研究多集中在短肽特別是二肽的一級結構與功能的關系方面，而花生短肽的構象與ACE抑制活性的關系，即高級結構與功能的關系研究卻較少。針對上述問題，本實驗采用RP-HPLC、MALDI-TOF-TOF MS鑒定了高活性ACE抑制肽的一級結構，通過固相合成的方法合成相同序列的短肽，并進一步驗證了其ACE抑制活性；采用量子化學方法對短肽的化學結構與空間構象進行了分子模擬。本研究旨在明確高活性ACE抑制肽的氨基酸序列，揭示其高級結構與功能的關系，為實現花生ACE抑制肽的功能化結構設計及加工過程調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生分離蛋白為本實驗室自制；Alcalase堿性蛋白酶 丹麥Novo公司；N120P蛋白酶 愛爾蘭凱利公司；ACE、馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL) 美國Sigma公司。

Sephadex G-15 美國Pharmacia 公司；乙腈(色譜純) 德國Merk公司；三氟乙酸(TFA) 美國Fluka公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHL-A電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動部分收集器、微型旋渦混合儀、DH-5紫外檢測器 上海滬西分析儀器廠；GL-16G-II冷凍離心機 上海安亭科學醫學儀器廠；ProStar 218半制備RP-HPLC 美國Varian公司；Waters Breeze高效液相色譜儀 美國Waters公司；4700 Proteomics Analyzer質譜儀 美國Framingham公司；Discovery Studio 3.5 Software 美國Accelrys公司。

1.3 方法

1.3.1 花生蛋白水解物的制備和分級

參考張宇昊等[6-7]方法對花生蛋白水解物進行制備與分級。

1.3.2 ACE抑制活性的測定[8]

[8]方法進行，ACE抑制率達到50%時的抑制劑質量濃度即為半抑制質量濃度，記為IC50。

1.3.3 Sephadex G-15分離純化ACE抑制肽

將處理好的Spehadex G-15裝柱(1.6cm×60cm)。稱取一定量的PP-Ⅲ凍干粉，溶于蒸餾水中，配成100mg/mL的溶液，取3mL溶液上柱，并用蒸餾水以0.3mL/min的流速洗脫，于220nm波長處檢測。洗脫組分分管收集，每管收集10min。重復上樣，合并每次分離時相同位置的組分峰，組分峰冷凍干燥。分別測定每個組分峰的ACE抑制IC50值，選出降血壓活性最強的組分PP-Ⅱ。

1.3.4 半制備RP-HPLC分離純化ACE抑制肽

HPLC系統：Varian Pro Star 218；色譜柱：Varian C18(21.2mm×150mm)；色譜條件：流速10mL/min，檢測波長214nm，進樣量1mL，柱溫25℃；洗脫條件：0～50min，95%～70% A，5%～30% B (A：水+0.05% TFA；B：乙腈+0.05% TFA)。配制質量濃度為10mg/mL的樣品溶液，重復進樣，洗脫峰自動收集后凍干。

1.3.5 質輔助激光解吸電離MALDI-TOF-TOF MS測定短肽氨基酸序列

將1μL樣品溶液與1μL 5mg/mL基質溶液(α-氰基-4-羥基肉桂酸溶于含0.1% TFA的50%乙腈中)混合，點于MALDI靶板上，待溶液干燥后進行MALDI-TOF-TOF MS分析。質譜條件：4700 Proteomics Analyzer質譜儀(配4700 Explorer分析軟件，Applied Biosystems，USA)；激光源波長355nm，正離子模式檢測，頻率20Hz，加速電壓20kV。MS-MS用標準血纖維蛋白肽B進行外標校正，用4700 Explorer軟件自動獲取數據進行分析處理。基質和樣品的肽質量指紋譜(peptide mass fi ngerprinting，PMF)質量掃描范圍為600～1000D。一級MS掃描完成后，選擇所需的肽段離子進行MS-MS分析，用DeNovo Explorer分析工具解析多肽的氨基酸序列。

1.3.6 短肽KLYMRP的合成

按照已鑒定出的一級序列，采用固相合成法合成短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro(KLYMRP)，樣品純度大于95%。

1.3.7 ACE抑制活性短肽量子化學計算方法

依照短肽P8的氨基酸序列(KLYMRP)構建短肽鏈狀初始結構。通過分子動力學模擬進行構象優化，主要步驟包括預處理、賦予立場、添加溶劑環境、升溫、平衡、采樣。

采用Discovery Studio軟件中的半柔性對接D S_CDOCKER這一模塊進行分子對接。對接采用的受體分子-ACE來自于蛋白結構數據庫PDB(Protein Data Base)，代碼為1UZE(complex of the anti-hypertensive drug enalaprilat and the human testicular angiotensin Ⅰ-converting enzyme，人的血管緊張素轉化酶與抗高血壓藥依那普利的復合物)，配體為經過動力學模擬優化后的短肽分子KLYMRP，受體的活性位點通過對ACE配合物中抑制劑分子(依那普利-EAL3002)獲得。綜合對接結果進行評估，判斷最穩定復合物構象。

2 結果與分析

2.1 高ACE抑制活性花生短肽組分篩選

表 1 半制備RP-HPLC 分離純化花生肽PP-Ⅱ各組分ACE抑制率Table 1 ACE inhibitory activity of components in fraction PP-Ⅱ separated and purified by semi-preparative RP-HPLC

通過Sephadex G-15分離小于1kD的花生短肽，篩選出降血壓活性最強的組分PP-Ⅱ，其IC50值可達0.091mg/mL。將PP-Ⅱ經RP-HPLC分離得到27個主要組分，由表1可知，各組分均有很強的ACE抑制活性，其中組分8(記作P8)ACE抑制活性最強，抑制率達85.77%。其次為組分3和組分11，ACE抑制率分別為66.79%和66.15%，因此選擇組分P8進行結構鑒定。

2.2 MALDI-TOF-TOF MS解析ACE抑制肽的氨基酸序列

圖 1 短肽P8的MALDI MS-MS圖譜Fig.1 MALDI MS-MS spectrum of P8

對花生短肽P8進行MALDI-TOF-TOF解析，母離子的碎裂離子經二級質譜分析得到MS-MS圖譜。由圖1可知，m/z 810.80的峰為分子離子峰[M+2H]2+，P8的相對分子質量為808.80(理論相對分子質量808.70)。利用軟件解析得到P8的氨基酸序列為Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro。對P8的ACE抑制活性進行測定，得到IC50值為0.0052mg/mL(6.42μmol/L)。

2.3 合成短肽KLYMRP的ACE抑制活性驗證

為進一步驗證短肽KLYMRP的功能活性，采用固相合成方法合成了具有相同氨基酸序列的短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro，并對合成肽活性進行測定，其ACE抑制IC50值為0.0038mg/mL(4.69μmol/L)。實驗證實此種氨基酸序列的短肽具有明顯的體外ACE抑制活性，且合成短肽的活性高于花生蛋白源短肽KLYMRP，原因可能是ACE抑制肽各氨基酸之間可形成多種不同構象，肽鏈的空間構象與其功能活性也存在一定的相關性。

目前已有從花生蛋白中分離出了不同的ACE抑制肽的報道，如黎觀紅等[9]利用堿性蛋白酶Alcalase對花生分離蛋白進行水解，分別得到了Gln-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys和Lys-Ile-Phe-Leu-Arg-Leu-Ser 2種ACE抑制肽，其IC50值分別為10.60μmol/L和36.60μmol/L。也有研究者[10]分離純化出花生ACE抑制肽Tyr-Gly-Asn-Leu-Tyr，當質量濃度為0.05mg/mL時，ACE抑制率達78.81%。此外利用乳酸菌發酵法從花生蛋白中分離純化出1種八肽Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys，其ACE抑制IC50值為23.30μg/mL[11]。Quist等[12]以胃蛋白酶和胰蛋白酶為工具酶先后酶解脫脂烘烤后花生粉，純化分離出序列為Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro的九肽，其IC50值為0.36μg/mL。Guang等[13]以Alcalase為工具酶制備花生ACE抑制肽，得到序列為Lys-Ala-Phe-Arg的短肽，其IC50值為16.90μg/mL。與上述ACE抑制肽相比，本實驗中分離得到的花生肽KLYMRP具有較高的ACE抑制活性。

2.4 短肽KLYMRP氨基酸組成與ACE抑制活性關系

Eresha等[14]比較了部分ACE抑制肽的結構與活性的關系，表明ACE底物或抑制劑的C末端三肽結構對其與ACE的結合起著重要的影響，ACE傾向C末端三肽的每個位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制劑。當C末端氨基酸為芳香族氨基酸(Trp、Tyr及Phe)和Pro，以及N末端為疏水性脂肪族支鏈氨基酸(Leu、Ile、Ala、Met)、芳香環氨基酸(Tyr、Phe、Try、Thy)和堿性氨基酸(Lys、Arg、His)時最有利于其與ACE的結合，但C末端若為二羧基氨基酸(如Glu)或Pro位于C末端倒數第2位和N末端時親和力將大大降低[15-19]。本實驗中分離出的短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro的C末端為Pro，N末端為堿性氨基酸Lys，且肽的疏水性很強，符合上述規律，因此有利于與ACE活性部位的結合。

2.5 短肽KLYMRP構象與ACE抑制活性的關系

短肽的生物活性除了與一級結構氨基酸數量、種類和序列有關系之外，也與其構象存在關系，但目前對于ACE抑制肽高級結構與活性的關系研究尚不深入。本研究依據量子化學理論對ACE抑制肽的活性部位進行了推測，初步探討了其ACE抑制活性與構象的關系，以期為ACE抑制肽的功能化結構設計提供理論參考。

2.5.1 短肽KLYMRP構象優化

依照花生短肽P8的氨基酸序列(KLYMRP)構建短肽鏈狀初始結構。通過分子動力學模擬進行構象優化，搜索并分析其最低勢能構象，即該短肽最穩定的分子構象，用于之后的分子對接環節。圖2為CHARMm立場下，400ps的動力學模擬后短肽最穩定分子構象。

圖 2 短肽KLYMRP最穩定分子構象Fig.2 Most stable molecular conformation of KLYMRP

2.5.2 短肽KLYMRP與ACE之間的相互作用分析

圖 3 CDocker Energy最高的短肽KLYMRP-ACE復合物構象Fig.3 Formation of KLYMRP-ACE complex with the highest CDocker energy score

ACE對血壓、電解質和體液平衡、心血管系統發育和結構重塑起重要調節作用，短肽能夠與ACE作用從而達到調節血壓作用。將短肽KLYMRP作為配體分子置于受體分子ACE的活性位點，經軟件計算后得分最高的短肽KLYMRP-ACE復合物構象見圖3。

通過對KLYMRP與ACE相互作用的分析可知，Glu162、Asp358、Asp377及Arg522是ACE活性位點的關鍵組分，它們是負責穩定結構及結合強度的主要殘基(表2)。短肽KLYMRP與ACE形成了5個氫鍵，包括短肽的O119原子和O120原子與ACE 522位的Arg形成氫鍵，短肽的H21原子、H22原子、H102原子分別與ACE 377位的Asp、162位的Glu、358位的Asp形成氫鍵(圖4)。綜合鍵長、鍵角的情況，Glu162、Asp377與短肽中H21原子、H22原子形成的氫鍵鍵長較短，鍵角較大，作用力較強(表3)，在KLYMRP與ACE的相互作用中起著穩定結構的關鍵作用。ACE 522位的Arg為其活性口袋的關鍵氨基酸，在配體與受體的結合中起著重要的作用[20]。短肽還與ACE357位的Trp成Pi-Cation相互作用，進一步穩定了相互作用關系。

圖 4 短肽KLYMRP與ACE相互作用細節圖Fig.4 Details of the ACE/KLYMRP interaction

表 2 短肽KLYMRP與ACE之間相互作用力Table 2 Interaction energy between the KLYMRP and ACE

表 3 短肽KLYMRP與ACE之間形成的鍵長和鍵角Table 3 Bond length and bond angle of hydrogen bonds observed between KLYMRP and ACE

ACE與鋅離子的相互作用可以抑制ACE的活性，在活性位點中起到極為重要的作用[21]。由圖5可知，短肽與ACE對接后，短肽中O64原子與O81原子與鋅離子之間的距離分別為2.17、2.29?，接近于氧原子(1.40?)與鋅離子(0.74?)的共價半徑總和(2.14 ?)[22-23]，表明短肽可以通過羰基與鋅離子形成配位鍵，連同His383、His387及Glu411這3個殘基一起與鋅離子結合。

圖 5 短肽KLYMRP、ACE與Zn2+相互作用細節圖Fig.5 Details of the KLYMRP/Zinc ion interaction at the ACE-active site

綜上分析可見，短肽KLYMRP與ACE活性位點的殘基形成5個氫鍵，一個Pi-Cation相互作用，并與鋅離子形成配位鍵，這些作用力共同穩定了短肽-ACE復合物的構象，從而有利于ACE抑制活性的發揮。

3 結 論

3.1 采用制備型RP-HPLC對經超濾、凝膠過濾色譜分離得到的花生ACE抑制肽組分進一步分離純化，主要得到27個組分，其中P8的ACE抑制活性最高，在0.010mg/mL質量濃度條件下ACE抑制率達85.77%。

3.2 經過MALDI-TOF-TOF MS序列分析，ACE抑制肽P8的相對分子質量為808.80，氨基酸序列為Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro(KLYMRP)，其ACE抑制IC50值為0.0052mg/mL(6.42μmol/L)。通過固相合成的方法驗證此ACE抑制肽的活性，得到合成肽KLYMRP的ACE抑制IC50值為0.0038mg/mL(4.69μmol/L)。

3.3 構效關系分析結果表明，短肽KLYMRP的C末端為Pro，N末端為堿性氨基酸Lys，且肽的疏水性很強，有利于與ACE活性部位的結合。短肽KLYMRP與ACE活性位點的殘基形成五個氫鍵，短肽的O119原子和O120原子與ACE 522位的Arg形成氫鍵，短肽的H21原子、H22原子、H102原子分別與ACE 377位的Asp、162位的Glu、358位的Asp形成氫鍵。短肽KLYMRP與ACE357位的Trp形成Pi-Cation相互作用，并通過羰基與鋅離子形成配位鍵，連同His383、His387及Glu411這3個殘基一起與鋅離子結合，這些作用力共同穩定了短肽-ACE復合物的構象，有利于短肽ACE抑制活性的發揮。

參考文獻：

[1] 張宇昊, 王強. 花生蛋白的開發與利用[J]. 花生學報, 2005, 34(4)： 12-16.

[2] 柳杰. 花生粕抗氧化肽的研究[D]. 無錫： 江南大學, 2010.

[3] SU G W, CUI C, ZHENG L, et al. Isolation and identifi cation of two novel umami and umami-enhancing peptides from peanut hydrolysate by consecutive chromatography and MALDI-TOF/TOF MS[J]. Food Chemistry, 2012, 135： 479-485.

[4] ZALIANI A, GANCIA E J. Structure and activity of angiotensin Ⅰconverting enzyme inhibitory peptides from sake and sake lees[J]. Chemical Information and Modeling, 1999, 39： 525-533.

[5] 劉煥, 樂國偉, 施用暉, 等. 血管緊張素轉化酶二肽抑制劑的構效關系[J]. 計算機與應用化學, 2005, 22(8)： 631-635.

[6] 張宇昊, 王強, 周素梅. 花生降血壓肽的超濾分離研究[J]. 中國油脂, 2007, 32(7)： 28-31.

[7] 張宇昊, 王強. Alcalase酶水解花生蛋白制備花生短肽的研究[J]. 農業工程學報, 2007, 23(4)： 258-262.

[8] CHEUNG H S, CHUSHMAN D W. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochem Pharmacol, 1971, 20： 1637-1648.

[9] 黎觀紅, 樂國偉, 施用暉. 花生分離蛋白水解物中血管緊張素轉化酶抑制肽的分離純化與結構鑒定[J]. 中國糧油學報, 2010, 25(6)： 56-61.

[10] 王瑛瑤, 王璋, 陳尚衛. 花生ACE抑制活性肽的分離純化與結構鑒定[J]. 食品科學, 2008, 29(10)： 341-344.

[11] WANG N F, LI C Y, YAN Z. Purification and characterization of angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptide from lactic acid fermented peanut fl our[J]. Journal of Biotechnology, 2008, 136： 717-742.

[12] QUIST E E, PHILLIPS R D, SAALIA F K. Angiotensin converting enzyme inhibitory activity of proteolytic digests of peanut (Arachis hypogaea L.) flour[J]. Food Science and Technology, 2009, 42(3)： 694-699.

[13] GUANG C, PHILLIPS R D. Purification, activity and sequence of angiotensin Ⅰ converting enzyme inhibitory peptide from alcalase hydrolysate of peanut flour[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(21)： 10102-10106.

[14] ERESHA M, NIRANJAN R, SE K K. Anti-oxidant properties of a radical-scavenging peptide purified from enzymatically prepared fish skin gelatin hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(3)： 581-587.

[15] SUETSUNA K, UKEDA H, OCHI H. Isolation and characterization of freeradical scavenging activities peptides derived from casein[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11： 128-131.

[16] RAJAPAKSE N, MENDIS E, BYUN H G, et a1. Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid muscle peptides on free radical： mediated oxidative systems[J]. Journal of Nutrition Biochemistry, 2005, 16： 562-569.

[17] QIAN Z J, JUNG W K, KIM S K. Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purifi ed from hydrolysate of bullfrog skin, Rana catesbeiana Shaw[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(6)： 1690 -1698.

[18] TAKAHASHI N, TOGASHI S, WATANAHE S S, et a1. Antioxidatie collagen-derived peptides in human-placenta extract[J]. Placenta, 2002, 23： 497-502.

[19] FITZ R J, MEISEL H. Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin Ⅰ-converting enzyme[J]. British Journal of Nutrition, 2000, 84(Supp1 1)： 33-37.

[20] 陳芳進, 劉濤, 潘和平, 等. N端6-甲基辛酰基化修飾對小肽KTKKKFLKKT結構的影響[J]. 自然科學進展, 2009, 19(10)： 1056-1061.

[21] 郭慧青, 毛惠, 趙波, 等. 兩種血管緊張素轉化酶抑制肽作用于靶標的分子機理[J]. 食品科學, 2010, 31(23)： 1-5.

[22] PAN D D, CAO J X, GUO H Q, et al. Studies on purifi cation and the molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2012, 1(1)： 121-126.

[23] DAVID W O, NORMAN H N. Principles of modern chemistry[M]. New York： Saunders College Publishing, 1986.