醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的研究

時 敏，王 雪，馬麗娜，于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶(MTG，EC2.3.2.13，簡稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)是一種能催化轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)，催化蛋白質(zhì)中的賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)(或多肽)之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物的聚合酶[1]。它可通過胺的導(dǎo)入、交聯(lián)以及脫胺3種途徑改善蛋白質(zhì)的功能特性[2-3]。這種酶不僅可以改善食品的功能特性，通過交聯(lián)作用還可以開發(fā)新的具有更高營養(yǎng)特性的新食品資源[4-7]，因此在食品類生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用。而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的穩(wěn)定性較差，在常態(tài)條件下易失活[8]。文獻[9-11]采用將酶制成酶晶體，用磁性殼聚糖固定等方法提高酶的穩(wěn)定性、延長貯藏期，并提高其重復(fù)使用率。雖然對聚丙烯膜進行處理的方法有很多種[12-13]，但是將其表面涂層醋酸纖維素固定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶卻未見報道。以高分子分離膜作為載體的固定化酶膜能夠?qū)⒚傅拇呋匦院湍さ膬?yōu)良分離性能進行有機地結(jié)合，成為了近年來的研究熱點[14-16]。

醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜具有一定的吸附性、化學穩(wěn)定性、疏水性和機械性能優(yōu)良等優(yōu)點，用其固定化酶可提高酶在反應(yīng)體系中的活性和穩(wěn)定性，從而有利于酶的回收和產(chǎn)品的生產(chǎn)。本實驗利用醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜為載體固定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，研究不同固定化條件對固定化效率和催化效果的影響，并對固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶學性質(zhì)進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋酸纖維素 北京惠寶聯(lián)化科技有限公司；聚丙烯膜 北京塑料研究所；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 上海線磊生物科技有限公司。

丙酮 天津市基準化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉天津基準化學試劑有限公司；N-α-CBZ-Gln-Gly 上海竹源生物科技有限公司 ；三氯乙酸、FeCl3·6H2O 蘇州源景化工有限公司；L-谷氨酸γ-單羥肟酸 深圳市迪肯科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-260紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；高速離心機 北京醫(yī)藥公司；DF-101S焦熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州金育科貿(mào)有限公司；PHS-3C精密酸度計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜的制備

將5g醋酸纖維素溶于100mL丙酮中，待溶解完全成均一的膜液后，取聚丙烯膜浸于溶有醋酸纖維素的丙酮溶液中，自然成膜，以去離子水沖洗醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜數(shù)次干燥備用[17]。

1.3.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定

采用吸附、交聯(lián)相結(jié)合的固定化方法，取若干1cm2的醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜于三角瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶液和pH6.0的磷酸鹽緩沖液中，吸附一定時間。再加入一定量戊二醛進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將膜取出，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后干燥。并將干燥好的固定化酶膜浸入磷酸鹽緩沖液中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酶活力測定

采用Folk等[18]的分光異羥肟酸(hydroxamate)分析法測定。1個酶活力單位定義為：37℃時每分鐘催化1μmol N-α-CBZ-Gln-Gly生成單羥肟酸的酶量，單位是U/g膜。相對酶活力以每組中所測酶活力與該組中最高酶活力的相對百分比表示。

1.3.4 固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶學性質(zhì)

固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶學性質(zhì)包括對固定化酶的最適溫度和最適pH值[19]。

1.3.5 電鏡掃描(SEM)

將聚丙烯膜、醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜及在相同條件下，聚丙烯膜固定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜和醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜固定的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜進行電鏡掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶液質(zhì)量濃度對固定化效果的影響

圖 1 酶液質(zhì)量濃度對固定化酶膜酶活力的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the activity of immobilized enzyme membrane

在吸附時間4h、戊二醛添加量0.3g/100mL、戊二醛交聯(lián)時間4h的條件下，分別考察酶液質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25mg/mL對固定化酶活力的影響。由圖1可知，酶活力隨著酶液質(zhì)量濃度的增加而增大，在15mg/mL時達到最大值，隨后隨著酶液質(zhì)量濃度的增加而緩慢降低。說明醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜作為載體固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的量是有限的，酶液質(zhì)量濃度達到一定量后，醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜吸附的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶相互聚集，從而使酶活力降低。

2.2 吸附時間對固定化效果的影響

圖 2 吸附時間對固定化酶膜酶活力的影響Fig.2 Effect of adsorption time on the activity of immobilized enzyme membrane

在酶液質(zhì)量濃度15mg/mL、戊二醛添加量0.3g/100mL、戊二醛交聯(lián)時間4h的條件下，考察吸附時間為1、2、3、4、5h對固定化酶活力的影響。由圖2可知，酶活力隨著吸附時間的延長而增大，在3h達到最大值，隨后隨著吸附時間的進一步延長而降低。說明酶分子與載體反應(yīng)基團可相互結(jié)合，尤其在3h最為充分，此后酶分子相互聚集導(dǎo)致酶的活性中心互相遮蓋而使酶活力逐漸降低。

2.3 戊二醛添加量對固定化效果的影響

在酶液質(zhì)量濃度15mg/mL、吸附時間3h、戊二醛交聯(lián)時間4h的條件下，采用戊二醛添加量為0.、0.2、0.3、0.4、0.5g/100mL對固定化磷脂酶活力的影響。由圖3可知，固定化酶活隨著戊二醛添加量的增加而增加，在0.3g/100mL時固定效果最好，之后則隨著添加量的進一步增加而降低。這是因為在反應(yīng)開始時，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被戊二醛充分交聯(lián)，隨后達到飽和，進一步增加戊二醛的添加量那么戊二醛對酶就會產(chǎn)生一定的抑制作用，從而導(dǎo)致酶活力降低。

圖 3 戊二醛添加量對固定化酶膜酶活力的影響Fig.3 Effect of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized enzyme membrane

2.4 戊二醛交聯(lián)時間對固定化效果的影響

圖 4 戊二醛交聯(lián)時間對固定化酶膜酶活力的影響Fig.4 Effect of cross-linking time on the activity of immobilized enzyme membrane

在酶液質(zhì)量濃度15mg/mL、吸附時間3h、戊二醛添加量0.3g/100mL的條件下，考察戊二醛交聯(lián)時間為2、3、4、5、6h對固定化酶活力的影響。由圖4可知，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活力隨著戊二醛交聯(lián)時間的延長而增加，在4h時達到最大值，之后隨著交聯(lián)時間的進一步延長而減小。引起這一現(xiàn)象的原因可能是超過4h后時間過長，交聯(lián)程度過高，酶的活性中心被破壞，從而是的酶活力下降。

2.5 固定化酶膜最適pH值

圖 5 固定化酶膜與游離酶最適pH值Fig.5 Optimal pH of immobilized enzyme membrane and free enzyme

其他條件不變，分別在各自最適溫度條件下，在pH值為3～9范圍內(nèi)測定固定化酶和游離酶活力，并計算相對酶活力。由圖5可知，在相同設(shè)定條件下，固定化酶膜最適pH值為5～6，游離酶最適pH值為6～7，這與Ando等[19]報道的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適pH6～7相一致。說明酶經(jīng)固定化以后對pH值的敏感性降低。還可以看出，固定化酶膜在偏酸性的環(huán)境中比在偏堿性的環(huán)境中相對酶活力降低的幅度要小，原因可能是固定在膜上的酶構(gòu)象發(fā)生了變化，引起其對酸性環(huán)境的適應(yīng)性增強。

2.6 固定化酶膜最適溫度

圖 6 固定化酶膜及游離酶的最適溫度Fig.6 Optimal temperature of immobilized enzyme membrane and free enzyme

其他條件不變，分別在各自最適pH值條件下，在溫度范圍30～60℃水浴鍋內(nèi)測定固定化酶和游離酶活力，并計算相對酶活力。由圖6可知，在相同實驗設(shè)定條件下，游離酶最適溫度為35～40℃，當溫度超過40℃時相對酶活力顯著下降，而固定化酶最適溫度為45～50℃，當溫度超過50℃相對酶活力顯著下降。

2.7 電鏡掃描結(jié)果

圖 7 微孔膜及固定化酶的電鏡掃描圖Fig.7 Scanning electron microscopic images

圖7a中，膜呈纖維狀，錯亂交叉，排列不規(guī)則，但表面平整光滑。圖7b顯示，固定化后的膜的纖維表面附著一些顆粒或團狀的物體而顯得有些粗糙，但由于結(jié)構(gòu)松散，膜上固定的酶容易脫落[20]。圖7c中，膜表面致密、均勻，利于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定。圖7d中，膜表面大部分被酶覆蓋，且酶堆積的均勻，表明大部分酶固定在醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜的界面上，這種結(jié)構(gòu)較利于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定。

3 結(jié) 論

通過醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行固定，進行單因素試驗確定最佳固定化條件為：酶液質(zhì)量濃度15mg/mL、吸附時間3h、戊二醛添加量0.3g/100mL、戊二醛交聯(lián)時間4h。在最佳固定化條件下固定的酶活力可達16.1U/g膜。對固定化酶和游離酶的酶學性質(zhì)進行比較，得出游離酶最適溫度為35～40℃，而固定化酶膜最適溫度為45～50℃；游離酶最適pH值為6～7，固定化酶膜最適pH值為5～6，固定化酶比游離酶向酸性偏移。SEM圖顯示醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜表面結(jié)構(gòu)有利于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定。

[1] VARGAS M, ALBORS A, CHIRALT A, et al. Characterization ofchitosan- oleic acid composite f ilms[J]. Food Hydrocolloids, 2009,23： 536-547.

[2] ZHONG Yu, SONG Xiaoyong, LI Yunfei. Antimicrobial, physical and mechanical properties of kudzu starch-chitosan composite f ilms as a function of acid solvent types[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 84(1)：335-342.

[3] 王愛勤. 甲殼素化學[M]. 北京： 科學出版社, 2008： 42-43.

[4] 呂心泉, 安辛欣. 谷氨酞胺轉(zhuǎn)氨酶在肉制品中的應(yīng)用研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2002, 23(4)： 86-88.

[5] 梁海燕, 馬儷珍. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在肉制品加工中的應(yīng)用[J]. 肉類工業(yè), 2004(5)： 38-40.

[6] ANDO H, ADACHI M, UMEDA K, et al. Purification and characteristics of a novel transgloutaminase derived from microorganism[J]. Agric Biol Chem, 1989, 53： 2613-2617.

[7] 周楠迪, 陳堅. 谷氨酸胺轉(zhuǎn)胺酶的功能性質(zhì)及其在食品中的應(yīng)用方法[J]. 中國食品添加劑, 2000(1)： 54-59.

[8] 馬永強, 韓春然. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)酶晶體的制備及其酶學性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2011(8)： 150-156.

[9] 韓春然, 張娜. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)酶晶體的制備及其結(jié)構(gòu)表征[J].中國食品學報, 2011, 11(4)： 42-47.

[10] 劉穎, 王鑫. 磁性殼聚糖固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2011, 27(9)： 1081-1095.

[11] 李鴻玉, 厲重先, 李祖明. 磁性殼聚糖固定化果膠酶的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9)： 399-403.

[12] 尹艷紅, 王輝. 聚丙烯微孔膜表面接枝聚合丙烯酰胺的改性研究[J].膜科學與技術(shù), 2008, 28(1)： 55-59.

[13] 朱建明. 烯丙胺等離子體處理聚丙烯膜的酶固定化[J]. 廈門大學學報, 2007, 46(2)： 213-216.

[14] DI M, SITTINGER M, RISBUD M. Chitosan： a versatilebiopolymer for orthopaedic tissue engineering[J]. Biomaterials, 2005, 26： 5983.

[15] MOORE C M, AKERS N L, HILL A D, et al. Improving the environment for immobilized dehydrogenase enzymes by modifying Nafion with tetraalkylammonium bromides[J]. Biomacromolecules,2004, 5： 1241-1247.

[16] KATYAKIN A A, KOTEL'NIKOVA E A, LUKACHOVA L V, et al. Optimal environment for glucose oxidase in perfluorosulfonated ionomer membranes： improvement of first-generation biosensors[J].Anal Chem, 2002, 74： 1597-1603.

[17] 林繁華, 張慶慶, 湯斌, 等. 醋酸纖維素/聚丙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的研究[J]. 安徽工程科技學院學報, 2007, 22(3)： 16-19.

[18] FOLK J E, COLE P W. Structural reqyurements of specif ic substrates for guinea pig liver transglutaminase[J]. Biol Chem, 1965, 240(7)：2951-2960.

[19] ANDO H, ADACHI M, UMEDA K. Purif ication and characteristics of novel transglutaminase derived from microorganisms[J]. Agric Biol Chem, 1989, 53(10)： 711-716.

[20] 徐堅, 王玉軍, 駱廣生, 等. 利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶[J]. 化工學報, 2006, 57(10)： 2372-2376.