集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶假定底物的體外誘導表達及純化

秦春燕，陳 谷*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

藍細菌是一類分布廣泛、行光合作用的原核生物，被認為是植物葉綠體的祖先。它是研究光合生物基因表達調控的模式生物[1]，其脅迫響應機理一直是該領域的研究熱點。當脅迫壓力超過一定的閾值時，生物體會感知環境變化并將脅迫信號轉導到基因轉錄區域以調控響應基因的表達，通過激活一系列響應基因的轉錄、合成特定蛋白、生成特定代謝物來應對脅迫。這個過程涉及跨膜信號轉導[2]。藍細菌基因組中包含9個σ因子[3]，不同的σ因子的替換被認為是應對環境或細胞內變化改變基因表達模式的關鍵。其中SigG、SigH、SigI的功能未知，但被推斷為胞外功能σ因子(ECF σ)[3]。細菌中的研究發現大部分負責響應胞外刺激和脅迫壓力的ECF σ因子，其活力受到相對應并共轉錄的跨膜anti-σ因子結合抑制，在外界壓力脅迫條件下，金屬蛋白酶S2P(Site-2-Protease)在膜切割anti-σ因子跨膜區域解除對σ因子的抑制，啟動一系列σ因子識別基因的轉錄[4-5]。

集胞藻PCC6803中有4個S2P同源蛋白：Sll0862、Slr0643、Sll0528、Slr1821[6]，但其功能撲朔迷離。在此前的研究中發現，弱酸脅迫響應條件下(pH6.5)，slr0643缺失突變體Δslr0643與野生型(wild type，WT)相比生長停滯，提示Slr0643可能參與這一脅迫響應過程[7]，sll0862缺失突變體在氧化和熱脅迫響應中出現異常[8]，但其作用機理及底物均未明確。通過系統考察各個物種中S2P作用機理和底物特征，并深入分析集胞藻PCC6803的9個σ因子及anti-σ因子，發現了幾對σ因子和anti-σ因子的組合：SigE-ChlH(Slr1055)[9]、SigI(Sll0687)-Sll0688、SigG(Slr1545)-Slr1546及SigH(Slr0856)-Sll0857。這些anti-σ因子是否作為S2P底物被S2P剪切，從而介導脅迫信號級聯轉導呢？這是個非常有趣的問題。此外，文獻報道S2P對底物的剪切發生在S1P切割之后，且S2P剪切底物的效率受底物(跨膜蛋白anti-σ因子)的羧基端氨基酸影響[10]。例如，在體外大腸桿菌S2P蛋白酶(RseP)不能直接切割其底物RseA全長，但能有效切割其底物的截短片段RseA△(1～140)[10-12]。

故而通過體外重組系統，誘導表達并純化幾個可能的S2P底物，包括全長及截去羧基端部分序列的截短片段：Slr1055及Slr1055△(1～232)、Sll0688及Sll0688△(1～152)、Slr1546及Slr1546△(1～174)、Sll0857及Sll0857△(1～101)和RseA(1～148)[10]，為構建體外酶切體系，驗證S2P與anti-σ因子之間酶與底物的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

集胞藻PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803) 美國模式培養物集存庫；大腸桿菌(Escherichia coli)DH10B、BL21(CE3) 日本TaKaRa公司；pET-30b(+)質粒 美國Novagen公司。

1.1.2 試劑與儀器

限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶、蛋白質Marker 加拿大Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、質粒DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒 日本TaKaRa公司；DNA Marker 廣州東盛生物科技有限公司；Ni-IDA蛋白純化樹脂 美國Novagen公司；胰蛋白胨、酵母粉、乳糖、IPTG、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基二乙胺 美國Sigma公司；PCR儀iCycle、電泳裝置 美國Bio-Rad公司；UV2300紫外分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；其余試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，調節pH 7.0；32Y培養基：酵母粉32g/L、胰蛋白胨8g/L、甘油0.5%、NaCl 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L(pH7.6)；M9培養基：Na2HPO430g/L、KH2PO415g/L、 NH4Cl 5g/L、葡萄糖2g/L、硫胺素500μg/L。

1.2 重組質粒的構建

1.2.1 引物合成

在Cyanobase數據庫中(http：//genome.kazusa.or.jp/cyanobase/ Synechocystis)獲取slr1055、slr0688、slr1546、slr0857及其片段基因序列，采用Primer 5軟件設計引物(表1)。引物由上海英駿生物技術有限公司廣州分公司合成。

表 1 PCR擴增所用的引物Table 1 PCR primers used for DNA amplification

1.2.2 PCR擴增

采用改進的CTAB法提取集胞藻PCC6803基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增。反應體系：0.5μL PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、10μL PCR Buffer(Mg2+plus)、4μL dNTPs、1μL基因組模板，上下游引物各1μL(10μmol/L)，ddH2O補足體積至50μL。反應條件：94℃、3min，98℃、10s，58℃、15s，72℃、2min，72℃、5min。反應30個循環，取5μLPCR產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.3 構建重組質粒

將PCR產物和pET-30b(+)載體經相應的內切酶酶切，回收目的基因和載體片段，經T4 DNA連接酶22℃、10min連接后再經16℃連接過夜，取連接產物，轉化感受態E.coli DH10B。次日挑取單克隆，利用快速篩選法、PCR驗證、質粒雙酶切鑒定篩選陽性克隆，并送上海英駿生物技術有限公司廣州分公司進行DNA測序，鑒定正確的質粒分別命名為pF1055(CG80-A/CG80-B)、pF1055△(CG80-A/Q7)、pF0688(CG92-A/CG92-B)、pF0688△(CG92-A/Q4)、pF1546(CG93-A/CG93-B)、pF1546△(CG93-A/Q5)、pF0857(Q6-A/Q6-B)、pF0857△(Q6-A/Q6)、pFRseA(CG94-A/CG94-B)。

1.3 集胞藻6803中S2P蛋白酶假定底物的誘導表達和表達產物的分離純化

1.3.1 Slr1055及Slr1055△、Sll0688及Sll0688△、Slr1546及Slr1546△、Sll0857及Sll0857△和RseA(1～148)誘導表達

將鑒定正確的重組質粒p F 1 0 5 5、p F 1 0 5 5 △、pF0688、pF0688△、pF1546、pF1546△、pF0857、pF0688△、pFRseA均轉化感受態E.coli BL21(CE3)，鋪至含50μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培養皿上，次日，挑選單菌落，接種至5～10mL含有相應抗生素的LB液體培養基中，37℃培養過夜。按照1%接種量將過夜培養的菌液接種至10mL含相應抗生素的不同培養基(LB、32Y、M9)中，待菌液生長至A600nm至1.0左右時，加入IPTG或α-乳糖至不同的終質量濃度，不同溫度下誘導表達過夜。取樣進行SDS-PAGE分析，以誘導前的菌液作為對照，進行同樣操作。

1.3.2 誘導表達產物的分離純化

收集100mL誘導表達的菌體，加入10mL結合緩沖液(0.5mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl、5mmol/L咪唑，pH7.9)，冰浴超聲裂解細胞(工作3s，間隔3s，功率250W)至澄清透明，4℃收集菌體，16100×g離心20min，收集上清經0.45μm濾膜過濾，調節pH值至7.9。用IDA His Bind樹脂直接純化上清中的目的蛋白，用不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫，純化產物經SDS-PAGE分析檢測濃度和分子質量，純化蛋白樣品保存于－80℃備用。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

圖 1 重組質粒構建流程圖Fig.1 Flow chart of the construction of recombinant plasmids

以表1相應的引物從集胞藻PCC6803基因組中擴增出相應的目的基因并連接到pET-30b(+)載體中，構建流程見圖1。用快速篩選法篩選陽性菌落進行PCR及酶切鑒定(圖2)。鑒定正確的質粒進行了測序鑒定，確保目的片段正確插入pET-30b(+)中。

圖 2 重組質粒PCR產物的鑒定Fig.2 Identifi cation of recombinant plasmids

2.2 集胞藻PCC6803中S2P假定底物誘導表達條件的優化

2.2.1 RseA重組蛋白表達條件優化

圖 3 重組蛋白RseA的誘導表達Fig.3 Induced expression of putative substrates of RseA

由于大腸桿菌中S 2 P 蛋白酶R s e P 底物的R s e A (1～148)是大腸桿菌體內的蛋白，表達過程中容易被體內蛋白酶降解，故其誘導表達具有一定難度。實驗通過對IPTG濃度、培養基及溫度等條件的優化，成功誘導出RseA蛋白(圖3A、B)。并得到RseA最佳誘導表達條件：32Y培養基中添加0.2mmol/L IPTG在22℃條件下誘導10h(圖3B泳道2)。

2.2.2 Slr1546△重組蛋白表達條件優化

圖 4 重組蛋白Slr1546Δ的誘導表達Fig.4 Induced expression of putative substrates of Slr1546Δ

由圖4可知，誘導表達時間對Slr1546△重組蛋白的表達影響較大，最優表達條件為LB培養基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導10h以上(泳道5、6)。

2.2.3 Sll0688△重組蛋白表達條件優化

圖 5 重組蛋白Sll0688Δ的誘導表達Fig.5 Induced expression of putative substrates of Sll0688Δ

由圖5可知，在LB、32Y培養基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導8h以上Sll0688△重組蛋白均可得到高效表達。

2.2.4 Sll0857與Sll0857△重組蛋白表達條件優化

圖 6 重組蛋白Sll0857及Sll0857Δ的誘導表達Fig.6 Induced expression of putative substrates of Sll0857 and Sll0857Δ

由圖6可知，Sll0857 and Sll0857△重組蛋白誘導表達條件為：32Y培養基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導8h以上。

2.2.5 Slr1546與Sll0688重組蛋白表達條件優化

圖 7 重組蛋白Slr1546及Sll0688的誘導表達Fig.7 Induced expression of putative substrates of Slr1546 and Sll0688

由圖7可知，在32Y培養基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導8h以上，Slr1546及Sll0688重組蛋白均能得到有效表達。

2.2.6 Slr1055與Slr1055△重組蛋白表達條件優化

圖 8 重組蛋白Slr1055及Slr1055Δ的誘導表達Fig.8 Induced expression of putative substrates of Slr1055 and Slr1055Δ

由圖8可知，在32Y培養基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導8h以上，Slr1055及Slr1055△重組蛋白均能得到有效表達。

2.3 S2P假定底物的誘導表達

圖 9 S2P假定底物的誘導表達Fig.9 Induced expression of putative substrates of site-2-proteases

由上述實驗可知，成功誘導表達了各個假定底物：Slr1055及Slr1055△(1～232)、Sll0688及Sll0688△(1～152)、Slr1546及Slr1546△(1～174)、Sll0857及Sll0857△(1～101)。

2.4 集胞藻PCC6803中S2P假定底物的表達純化

之前對△slr0643(slr0643缺失突變體)與野生型的弱酸脅迫響應差異進行了基因芯片分析[6]，發現Slr0643很可能通過基因簇sll0856-sll0857-sll0858，控制Sigma因子(σH，Sll0856)的表達，即Slr0643/Sll0857/SigH通過S2P/antisigma factor/sigma factor 的級聯信號轉導模式調控酸脅迫下基因的轉錄[6]。因此首先重點純化了Sll0857以及其片段Sll0857△，得到純度較高的重組蛋白，如圖10所示。

圖 10 重組蛋白Sll0857、Sll0857Δ的表達純化Fig.10 Purifi cation of Sll0857 and Sll0857Δ

而后用最優條件誘導表達，并純化了幾個可能的底物全長及片段：Slr1055及Slr1055△(1～232)、Sll0688及Sll0688△(1～152)、Sll1546及Sll1546△(1～174)、RseA，如圖11所示。

圖 11 S2P假定底物的純化Fig.11 Purifi cation of putative substrate of site-2-protease

3 討 論

前期工作已經成功證實集胞藻PCC6803中的S2P蛋白酶Slr0643和Sll0862參與多種脅迫響應[14-16]，但是揭開它們的具體機制有賴于找到S2P的底物。此前成功在體外重組表達了Slr0643及Sll0862，并揭示它們能在體外切割β-Casein[6]具有蛋白酶活性。本研究通過系統考察各個物種中S2P作用機理和底物特征，深入分析集胞藻PCC6803的9個σ因子及anti-σ因子，鎖定了4對σ因子和anti-σ因子的組合：SigE-ChlH(Slr1055)[9]、SigI(Slr0687)-Sll0688、SigG(Slr1545)-Slr1546及SigH(Slr0856)-Sll0857。通過構建于pET載體，優化誘導表達條件，成功地獲得8個S2P假定底物：包括全長的anti-σ因子及其截斷的片段。

近年來，光合生物S2P的功能頗受關注。例如，AMOS1/EGY1介導了擬南芥應答銨鹽脅迫的響應，并與脫落酸信號調控通路相關，參與維持銨鹽脅迫下葉綠體的完整結構和功能[17]。但其具體的機理卻有待揭開S2P的底物才能完整解釋。依據其他生物體中S2P的研究結果，在正常生長條件下，σ因子被anti-σ因子束縛在膜上，無法識別并與RNA聚合酶的核心酶結合，故其無法調控相應基因的轉錄；當脅迫信號刺激啟動S2P級聯信號轉導，anti-σ因子將先后被S1P和S2P剪切，釋放所束縛的σ因子到核區，啟動其調控的基因簇轉錄。迄今為止，鎖定集胞藻PCC6803中的4對σ因子和anti-σ因子的組合，是光合生物研究中的首個關于S2P底物的研究。通過重組表達純化4個anti-σ因子及其截短片段，下一步將在體外重構S2P與假定底物之間的酶切體系，考察酶與底物的相互關系。當然，集胞藻PCC6803中4個S2P蛋白酶：Sll0862、Slr0643、Sll0528、Slr1821均含有多個跨膜區域、導致其表達純化非常困難。下一步實驗將進一步優化表達純化這4個S2P蛋白酶的條件，獲取更多有活性的蛋白酶，來構建體外酶切體系，為闡釋藍藻體內S2P介導的級聯信號轉導機制提供進一步證據。

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