螞蟻抗菌肽的分離純化及其活性

蘇 翔，崔敬愛，陳曉平

(吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

抗菌肽是一類活性小肽，廣泛存在于生物體內(nèi)。它具有抗菌能力強、抗菌譜廣、種類多、可供選擇范圍廣、靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等特點[1-2]。近年來，國內(nèi)外對各類抗菌肽的研究取得很大進展，在很多微生物對抗生素產(chǎn)生抗藥性的今天，抗菌肽將會成為新一代的臨床抗菌藥物，在化妝品、生物農(nóng)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑和動植物抗病基因工程方面也將有著廣闊的應(yīng)用前景[3-6]。螞蟻體內(nèi)含有特殊的“螞蟻抗生素”[7]。此外，螞蟻還有生活適應(yīng)能力強、世代周期短、繁殖力高等生物學特點，故研究螞蟻抗菌肽的分離純化工藝對開拓螞蟻抗菌肽資源具有重要意義[8-9]。本研究通過對螞蟻抗菌肽的分離純化及某些抗菌活性的研究，為以后開展此項研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螞蟻，購于吉林農(nóng)業(yè)大學立新參茸店。

乙醇(分析純) 北京化工廠；葡聚糖凝膠柱Sephadex G-25 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；標準蛋白質(zhì)(SM1891) 加拿大Fermentas公司；測試菌株 由吉林農(nóng)業(yè)大學食品工程教研室提供。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基：參考《分子克隆實驗指南》中培養(yǎng)基配方配制。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050真空干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；XA-1組織粉碎機 金壇市科析儀器有限公司；DY89-1電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21LM高速冷凍離心機 湖南星科科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-1C-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DYY-11電泳儀 北京市六一儀器廠；電子恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗提物的制備

將螞蟻洗凈，放在托盤內(nèi)攤平。將托盤放入真空干燥箱，在40℃條件下烘干至質(zhì)量恒定。用組織粉碎機進行粉碎，過60目篩得螞蟻粉。取10g螞蟻粉按料液比1：30(m/V)加入60%乙醇，用電動勻漿機勻漿后在4℃條件下浸提24h。濾紙過濾，將提取液在4℃、7000r/min條件下離心20min，取上清液，于－80℃冰箱凍藏，得螞蟻抗菌肽粗提液。將粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇，真空冷凍干燥制成褐色粉末，即螞蟻抗菌肽的粗提物。

1.3.2 螞蟻抗菌肽的純化

參考陸婕等[10]方法，采用加熱-層析法對螞蟻抗菌肽粗提液進行分離純化。將粗提液置于100℃水浴中保溫20min，然后在4℃、15000r/min條件下離心30min，收集沉淀，得熱變性蛋白記為a，將上清液冷凍干燥，得到干物質(zhì)記為b。對熱變性蛋白a及干物質(zhì)b進行抑菌實驗，檢測其有無抑菌活性。將有抑菌活性的干物質(zhì)b溶于5mL去離子水上柱，以濃度為0.05mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫，進行Sephadex G-25柱層析分離。用自動部分收集器收集，設(shè)定12min收集1管。用紫外分光光度計在波長280nm處測其吸光度，收集洗脫峰，進行抑菌實驗，有抑菌作用的峰值管里物質(zhì)即為螞蟻抗菌肽的提純物。

1.3.3 螞蟻抗菌肽的抑菌活性

1.3.3.1 抑菌活性檢測

采用瓊脂孔穴擴散法[11]，以大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)為受試菌。將大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基與營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，振蕩后放于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，活化2～3次。將加熱融化的LB固體培養(yǎng)基15mL注入到平皿中，待凝固后，吸取菌濃為103CFU/mL的2種受試菌液各100μL加入不同平皿[12]，涂布均勻。在培養(yǎng)基已挖好的孔洞里加入40μL提取液，并做陰性、陽性對照。其中陰性對照為蒸餾水，陽性對照為質(zhì)量濃度100μg/mL的氨芐青霉素溶液。置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑。實驗重復3次，計算平均值。

1.3.3.2 SDS-PAGE檢測

配制5mL 15%分離膠和2mL 5%濃縮膠，電泳開始時，在80V電壓下電泳30min左右，待指示前沿到達分離膠上沿時，將電壓調(diào)至130V，至藍色指示前沿至分離膠3/4位置時停止電泳。將膠置于5%戊二醛溶液中固定30min，再經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色1h，脫色過夜，直至顯現(xiàn)出清晰的蛋白質(zhì)條帶[13]。

1.3.3.3 標準曲線法測定抗菌肽分子質(zhì)量

以標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標，相對遷移率為橫坐標作圖，得到標準曲線[14]。根據(jù)樣品蛋白質(zhì)在電泳圖譜上的相對遷移率，計算出其分子質(zhì)量。

1.3.3.4 最小抑菌質(zhì)量濃度測定

采用微量液體檢測法[15]，對定量的螞蟻抗菌肽提純物作2倍遞減濃度稀釋，分別為0.020312、0.040625、0.08125、0.1625、0.325、0.65、1.3mg/mL，對大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)、枯草芽孢桿菌(ATCC 11060)做抑菌實驗，抑菌圈直徑在10mm以上的為最小抑菌質(zhì)量濃度[16]。實驗重復3次，計算平均值。

1.3.3.5 耐熱性檢測

將螞蟻抗菌肽配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的溶液，在80、100、121℃條件下分別加熱30min，對大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌做抑菌實驗，觀察抑菌圈直徑變化，以未經(jīng)加熱的抗菌肽溶液為對照。實驗重復3次，計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex G-25柱層析分離結(jié)果

圖 1 變性蛋白a及干物質(zhì)b對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic capacity of denatured protein a and dry material b on to Escherichia coli and Staphylococcus aureus

由圖1可見，陽性對照氨芐青霉素溶液對大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈明顯，而陰性對照蒸餾水則無抑菌圈。與氨芐青霉素溶液與蒸餾水對照，熱變性蛋白a對大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌均無抑菌作用，干物質(zhì)b則對兩種細菌抑菌作用明顯，可見加熱能除去不耐熱蛋白，有利于耐熱性好的抗菌肽的分離。

干物質(zhì)b經(jīng)Sephadex G-25柱層析分離后，用紫外分光光度計在波長280nm處測其吸光度，結(jié)果如圖2所示。通過抑菌實驗，抗菌肽在第30和31號收集管中。

圖 2 Sephadex G-25柱層析分離結(jié)果Fig.2 Chromatographic separation of antimicrobial peptide on Sephadex G-25 column

2.2 SDS-PAGE電泳測分子質(zhì)量

圖 3 樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of antimicrobial peptide samples

將經(jīng)加熱-層析法得到的樣品進行SDS-PAGE電泳，并根據(jù)標準曲線計算其相對分子質(zhì)量。電泳圖如圖3所示。由圖3可見，經(jīng)加熱-層析法所制得的樣品在膠上表現(xiàn)為單一蛋白條帶。以標準蛋白的相對遷移率為橫坐標，相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)回歸方程y=－2.6865x＋2.1712(R2=0.9869)，計算出螞蟻抗菌肽提純物的分子質(zhì)量為3.746kD。

2.3 螞蟻抗菌肽提純物的最小抑菌質(zhì)量濃度

表 1 螞蟻抗菌肽的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of antimicrobial peptides from ants

由表1可知，螞蟻抗菌肽對4種細菌都有一定的抑菌效果，對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.325、0.65、0.1625、0.325mg/mL。

2.4 螞蟻抗菌肽的耐熱性

圖 4 不同溫度加熱對螞蟻抗菌肽抑菌效果的影響Fig.4 Bacteriostatic effect of peptides from ants subjected to heating treatment at various temperatures

由圖4可知，螞蟻抗菌肽在80℃和100℃加熱后對大腸埃希氏菌的抑菌活性變化不大，在121℃抑菌活性出現(xiàn)下降，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性隨加熱溫度增大有所增強?？梢娢浵伩咕木哂休^好的耐熱性。

3 討 論

抗菌肽對很多致病菌均具有抑菌作用，具有廣譜抑菌效果。目前國內(nèi)外關(guān)于抗菌肽對腫瘤細胞的殺傷作用進行了大量研究，且取得了很大進展[17-18]。本實驗結(jié)果表明，分離純化出的螞蟻抗菌肽對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、枯草芽孢桿菌均具有很好的抑菌效果。至于螞蟻抗菌肽對于其他致病菌和腫瘤細胞有無抑制及殺傷作用有待今后進一步研究。

螞蟻抗菌肽的提純工藝目前處于實驗研究階段，較難進行大規(guī)模生產(chǎn)。本實驗在分離純化過程中，利用抗菌肽的耐熱性，采用加熱-層析法得到了螞蟻抗菌肽提純物，相比其他傳統(tǒng)提純工藝，大大簡化了工藝步驟，在大規(guī)模生產(chǎn)中將會降低企業(yè)生產(chǎn)成本，且加熱能使外源性蛋白酶變性失活，避免抗菌肽發(fā)生降解，有利于在生產(chǎn)中保證其質(zhì)量和穩(wěn)定性。本實驗未對螞蟻抗菌肽提純物進行氨基酸組成和結(jié)構(gòu)分析，有待于進一步研究。

螞蟻的世代周期短、繁殖力高等生物學特點決定了其資源豐富且價格低廉，從螞蟻中提取抗菌肽仍具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

經(jīng)乙醇浸提和加熱層析，得到純度較高、耐熱性好的螞蟻抗菌肽。其分子質(zhì)量為3.746kD。螞蟻抗菌肽對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.325、0.65、0.1625、0.325mg/mL。

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