發(fā)酵芝麻粕中芝麻小肽的分離純化及其體外抗氧化活性

彭惠惠，李呂木,,,*，錢 坤，許發(fā)芝，吳 東，周 芬，丁小玲

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；3.安徽省畜牧生物工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230031)

芝麻屬胡麻科胡麻屬，在亞洲廣泛種植，榨油后的副產(chǎn)物麻渣或餅粕中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38%～50%，芝麻蛋白中氨基酸含量豐富。大量研究證實(shí)蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)并不是全部以單個(gè)氨基酸形式被吸收，部分是以小肽的形式被吸收，且小肽被吸收的效果要比氨基酸好[1]，同時(shí)小肽還具有特殊的生物活性功能如抑制血壓升高[2]、抗疲勞[3]、增強(qiáng)免疫功能[4]及降低膽固醇[5]等作用，而這些作用均與其抗氧化性質(zhì)有關(guān)。芝麻蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，酶解物具有體外抗氧化活性，在質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，對(duì)·OH、超氧陰離子自由基都有明顯的清除作用[6]。在微生物固態(tài)發(fā)酵芝麻粕以提高其飼用品質(zhì)的過程中也產(chǎn)生了一定量的小肽[7]，但這種小肽是否也具有很好的抗氧化活性，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)選取枯草芽孢桿菌和乳酸菌混菌發(fā)酵的芝麻粕為原料，研究其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的小肽的抗氧化能力，為芝麻小肽在食品、飼料等領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發(fā)酵芝麻粕：枯草芽孢桿菌和乳酸菌混菌接種比例1：1，菌種由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料科技研究所提供，接種量8%，30℃固態(tài)厭氧發(fā)酵14d，小肽含量7.13%。

藍(lán)色葡聚糖-2000、L-酪氨酸、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽 北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-15 北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

752紫外-可見分光光度計(jì) 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DHL-A電腦恒流泵、HD-21-1核酸蛋白檢測(cè)儀、SBS-100自動(dòng)液相色譜層析儀 上海青浦滬西儀器廠；層析柱(2.6cm×60cm) 上海錦華層析設(shè)備廠；多功能有機(jī)膜實(shí)驗(yàn)設(shè)備 合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 芝麻小肽粗提

稱10g發(fā)酵芝麻粕加100mL純水150r/min浸提30min，溶液過0.45μm濾膜后，用1000D納濾膜過濾，取分子質(zhì)量小于1000D部分濃縮待測(cè)。

1.2.2 芝麻小肽分離純化

采用Sephadex G-15凝膠層析柱對(duì)芝麻小肽粗體液進(jìn)行分離純化。用pH7.0雙蒸水洗脫，樣品質(zhì)量濃度為70mg/mL，上樣量為lmL，流速為0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

凝膠層析組分小肽分子質(zhì)量測(cè)定用藍(lán)色葡聚糖-2000測(cè)定外體積V0，用鉻酸鉀測(cè)總體積Vt。分別用L-酪氨酸(M=181.19)、還原型谷胱甘肽(M=307.32)、氧化型谷胱甘肽(M=612.6)上柱，層析柱(2.6cm×60cm)，洗脫液為雙蒸水，上樣量為lmL，洗脫流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，得出標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積Ve。計(jì)算得到系數(shù)Kav=(Ve－V0)/(Vt－V0)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgM)為橫坐標(biāo)，系數(shù)Kav為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用芝麻小肽粗提液代替標(biāo)準(zhǔn)蛋白，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法操作，得出洗脫體積，重復(fù)測(cè)定1～2次，取洗脫體積的平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程算出樣品的分子質(zhì)量。

1.2.4 小肽含量測(cè)定

采用Lowry-福林酚法[8]，重復(fù)測(cè)定2次。

1.2.5 DPPH自由基清除作用的測(cè)定[9]

準(zhǔn)確稱取20mg DPPH用無水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液。利用DPPH溶液的特征紫紅色團(tuán)波長(zhǎng)517nm的吸收峰，測(cè)定加入樣品后A517nm吸收的下降表示其對(duì)有機(jī)自由基的清除能力。

取2mL不同質(zhì)量濃度的樣品液，加入2mL 2×10-4mol/L (0.1mmol/L)的DPPH無水乙醇溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30min后測(cè)定波長(zhǎng)517nm處的吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定2mL DPPH+2mL乙醇的吸光度A0和2mL樣品液+ 2mL乙醇混合后的吸光度Aj。重復(fù)測(cè)定2次。計(jì)算DPPH自由基的清除率。

1.2.6 ·OH清除作用的測(cè)定[10]

在10mL試管中依次加入6mmol/L硫酸亞鐵溶液 2.0mL，不同質(zhì)量濃度的小肽溶液2.0mL，6mmol/L雙氧水溶液2.0mL，搖勻后靜置10min，再加入6mmol/L水楊酸溶液2.0mL，搖勻后靜置30min后于波長(zhǎng)510nm處測(cè)定其吸光度。重復(fù)測(cè)定2次。

式中：A0為不加樣品液的本底吸光度；As為加入樣品溶液反應(yīng)后的吸光度；Ax為不加水楊酸溶液酶解液的吸光度。

1.2.7 還原力測(cè)定[11]

具塞試管中依次加入0.5mL小肽溶液、2.5mL 0.2mol/L PBS磷酸緩沖液(pH6.6)、2.5mL 1.0% K3(Fe(CN)6)，迅速混勻，50℃水浴中反應(yīng)20min，冰水冷卻并加2.5mL 10%三氯乙酸(TCA)，混勻后以3000r/min離心10min。取2.5mL上清液，加2.5mL雙蒸水和0.5mL 0.1%三氯化鐵，混勻，測(cè)定各樣品在700nm波長(zhǎng)處的吸光度。用蒸餾水作為無還原能力對(duì)照。重復(fù)測(cè)定2次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用藍(lán)色葡聚糖-2000測(cè)定外體積V0=41.8mL，用鉻酸鉀測(cè)總體積Vt=76.1mL，L-酪氨酸(M=181.19)、還原型谷胱甘肽(M=307.32)、氧化型谷胱甘肽(M=612.6)的洗脫體積分別為91.65、67.20、44.51mL。擬合得到回歸方程：y =－0.3841x + 2.802，回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.9904，說明lgM與Kav線性相關(guān)。

2.2 Sephadex G-15檢測(cè)芝麻小肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布

芝麻小肽粗提液經(jīng)過Sephadex G-15凝膠色譜柱分離，得到了3個(gè)峰，如圖1所示，各個(gè)峰的洗脫體積分別是41.69、57.13、73.07mL，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的方程，得到酶解物中3個(gè)組分的分子質(zhì)量分布為：636、426、282D，即芝麻小肽粗體液分離得到的3個(gè)組分為六肽、四肽、三肽。經(jīng)凝膠柱分離小肽回收率達(dá)到60.2%，將收集的3個(gè)組分的洗脫液進(jìn)行冷凍存放，待進(jìn)一步分析。

圖 1 芝麻小肽Sephadex G-15柱層析洗脫圖譜Fig.1 Elution profi le of sesame peptide on Sephadex G-15

2.3 芝麻小肽對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基清除能力可以很好表達(dá)對(duì)于油溶性自由基的清除能力。DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若小肽能清除它，則小肽具有打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用[12]。由圖2可知，在高質(zhì)量濃度(mg/mL)條件下小肽粗提液的DPPH自由基清除率高于2,6-二叔丁基- 4-甲基苯酚(BHT)，經(jīng)SAS軟件分析知，差異極顯著(P＜0.01)；但在低質(zhì)量濃度(0.1mg/mL)條件下，小肽粗提液的DPPH自由基清除率與BHT差異不顯著。表明芝麻小肽可以作為高效抗氧化劑。

圖 2 芝麻小肽粗提液與BHT清除DPPH自由基能力的比較Fig.2 Scavenging capacity of sesame peptide and BHT on DPPH free radicals

由圖3可知，芝麻小肽粗提液及分離得到的各肽組分均具有清除DPPH自由基的能力，并且在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基清除率呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在低質(zhì)量濃度下，三肽的抗氧化活性最強(qiáng)；四肽抗氧化性與芝麻小肽粗提液抗氧化能力接近；六肽的抗氧化性最弱。在高質(zhì)量濃度下，三肽、四肽和粗提液的DPPH自由基清除率均接近90%。初步可以推斷對(duì)于質(zhì)量濃度相同、分子質(zhì)量不同的小肽而言，清除DPPH自由基的能力隨著小肽分子質(zhì)量的減小而增大。上述結(jié)果與Chen等[13]的研究一致，肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量大小密切相關(guān)。這主要是因?yàn)榭寡趸钚噪暮心承┠芘c自由基反應(yīng)的特殊基團(tuán)即供氫基團(tuán)，只有當(dāng)小肽在適當(dāng)分子質(zhì)量時(shí)，這些特殊的供氫基團(tuán)才能得到最大的暴露充分與自由基作用，此時(shí)才具有較強(qiáng)的抗氧化性。

圖 3 芝麻小肽清除DPPH自由基能力的比較Fig.3 Scavenging capacity of sesame peptide on DPPH free radicals

2.4 芝麻小肽對(duì)·OH的清除作用

圖 4 芝麻小肽清除·OH能力的比較Fig.4 Scavenging capacity of sesame peptide on hydroxyl free radicals

由圖4可知，芝麻小肽在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度(0.1～1mg/mL)范圍內(nèi)對(duì)·OH均有清除作用，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，小肽的抗氧化活性也隨之增強(qiáng)，小肽中含有供氫體，具有提供質(zhì)子的能力，使具有高度氧化性的自由基還原，從而達(dá)到終止自由基連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的目的，因此，隨著質(zhì)量濃度的增加，供氫體增多，提供質(zhì)子的能力增強(qiáng)，其抗氧化性也就會(huì)隨之提高。凝膠層析分離所收集的各組分中，三肽和四肽組分清除·OH最強(qiáng)，清除率達(dá)到100%，粗提液和六肽清除率均達(dá)到90%。

2.5 芝麻小肽還原力

樣品還原力的大小可通過測(cè)定其吸光度的大小反映出來，吸光度越大則其還原力越強(qiáng)。由圖5可知，芝麻小肽在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度(0.5～5mg/mL)范圍內(nèi)總還原力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而消除自由基的[14]，因此還原力越強(qiáng)，其抗氧化性越強(qiáng)。隨著小肽質(zhì)量濃度的增加，小肽的抗氧化性也隨之增強(qiáng)；凝膠層析分離所收集的各組分中，組分3(三肽)的還原力最強(qiáng)，這一結(jié)果與清除DPPH自由基、·OH活性一致。還原型谷胱甘肽作為對(duì)照，其總還原力高于芝麻小肽各組分。4mg/mL的小肽粗提液、四肽、六肽，2mg/mL三肽和0.5mg/mL谷胱甘肽的吸光度相同，說明這些物質(zhì)的總還原力相當(dāng)。

圖 5 芝麻小肽總還原力的比較Fig.5 Total reducing power of sesame peptide

·OH等自由基誘導(dǎo)的氧化損傷被認(rèn)為是引起細(xì)胞損傷、死亡、癌變，組織傷害和衰老的原因之一。因此尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是關(guān)注的課題。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)芝麻肽的研究集中于酶解芝麻蛋白，由于使用單一的酶，得到的芝麻肽活性較低。本實(shí)驗(yàn)研究微生物固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)生的芝麻肽的抗氧化活性，綜合以上3種抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可以看出，在不同的實(shí)驗(yàn)體系中，分子質(zhì)量最小的三肽抗氧化能力最強(qiáng)，雖然在水系中芝麻三肽總還原力低于谷胱甘肽，但在油系中芝麻小肽清除DPPH自由基活力高于BHT，因此芝麻小肽在油脂抗氧化方面值得今后深入研究。芝麻肽具有較強(qiáng)的還原力，對(duì)·OH和DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除作用，且抗氧化性隨著芝麻肽分子質(zhì)量的降低而增強(qiáng)，可見芝麻肽的抗氧化活性與芝麻肽的分子質(zhì)量存在相關(guān)關(guān)系。抗氧化肽的抗自由基能力可能與其氨基酸組成和順序有關(guān)[15]，芝麻抗氧化肽富含供氫體，具有提供質(zhì)子的能力，可以使具有高度氧化性的自由基還原，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到清除或抑制自由基的目的。這些都可能是芝麻肽具有較強(qiáng)抗氧化作用的原因之一，但其詳細(xì)的抗氧化機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

固態(tài)發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)生的三肽、四肽和六肽均具有抗氧化活性，且抗氧化性隨著小肽分子量的降低而增強(qiáng)。芝麻小肽作為一種天然抗氧化劑，安全無毒副作用，在食品、飼料等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

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