不同加熱方法對牛肉酶解蛋白與葡萄糖反應活性的影響

吳 肖，孔令會，于立梅

(1.廣東匯香源生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225)

動物蛋白是形成豐滿圓潤醇厚口感的重要物質之一[1]。當動物蛋白酶解后經過不同能量方式作用，其風味形成和釋放機理存在差異[2-5]，在這個過程中參與的主要反應為蛋白質、肽和氨基酸的分解和降解作用以及Maillard反應，因而對不同加熱方法中蛋白類物質反應活性以及風味物質形成和釋放規律研究具有重要意義。牛肉風味是肉類風味研究中最為廣泛和深入的一種，主要集中的領域為：牛肉風味主要貢獻活性香氣化合物以及結構研究[6]、12-甲基十三醛濃度對動物生長發育的影響[7]、煮制牛肉肉質特性與芳香成分的影響[8]、煮制牛肉芳香成分、新噻唑類化合物等的鑒定[9-11]、存在煮制牛肉中的硫化合物的分離和鑒定[12]、烤制牛肉中芳香成分的鑒定[13]、肉制品加工和模擬肉味風味研究[14-15]，而對于牛肉呈味物質的研究較少。牛肉蛋白質經酶解后形成一定分子質量分布的蛋白質、肽和氨基酸，通過加入葡萄糖進行Maillard熱反應后形成牛肉風味類芳香物質。但是不同蛋白質、肽和氨基酸與葡萄糖的反應活性不同，而且未反應的酶解物和形成的牛肉風味物質呈味性能不同，相對于世界范圍內牛肉蛋白風味物質在不同反應體系中消長規律的研究，我國的研究起步較晚，我國源遠流長的食文化對風味物質的研究提出迫切的需求。本實驗以四川甘孜州的新鮮牦牛肉作為原料，經過相同的酶解工藝，分別運用不同的加熱方法(微波、高壓、熱空氣流、水蒸氣)和葡萄糖反應一段時間，對其產物進行風味物質的釋放規律的分析研究，為牛肉類風味物質的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉，四川甘孜州牦牛肉。

復合蛋白酶、風味蛋白酶 諾和諾德酶制劑公司；葡萄糖 廣州澤明科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

JJ1000型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠；LZB-4WB型玻璃轉子流量計 寧波市科奧流量儀表有限公司；JB90-D電動攪拌器 上海標本模型廠；ZCY-15A型恒溫油浴鍋 寧波天恒儀器廠；空氣凈化濾膜 上海名列化工科技有限公司；S-608型增氧泵 中山市日勝電器制品有限公司；高效液相色譜裝置 美國Waters公司；自制微波反應裝置、自制高壓反應釜。

1.3 實驗工藝

牛肉與水的質量比為1：1，預先攪碎稱其總質量，加入牛肉蛋白質總質量0.5%的復合蛋白酶和風味蛋白酶，在(55±1)℃的條件下酶解2h，然后再加入與牛肉蛋白質總質量相同量的葡萄糖，分別放入不同的熱反應體系中進行反應，然后進行感官品評，選擇牛肉風味和香氣較好的一組進行圖譜分析。

1.4 實驗體系

1.4.1 體系1-微波熱反應體系

將上述反應原料放入裝有電動攪拌器的自制微波反應設備中，設定溫度為(100±1)℃，待溫度上升至指定溫度時，開始計時，分別選取10、15、20、25、30min停止反應，迅速冷卻至常溫，稱其質量，保持質量恒定，低溫保存。所得樣品進行感官品評，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測定其分子質量分布曲線圖。

1.4.2 體系2-高壓熱反應體系

將上述反應原料放入自制的高壓反應釜中，設定壓力為1.5kgf，待壓力上升至指定壓力時開始計時，分別選取30、50、70、90、110min停止反應，迅速冷卻至常溫，稱其質量，保持質量恒定，低溫保存。所得樣品進行感官品評，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測定其分子質量分布曲線圖。

1.4.3 體系3-熱空氣流熱反應體系

將上述反應原料放入自制氣升式反應器中，設定溫度為(100±1)℃，通入預處理熱空氣并計時，分別選取30、50、70、90、110min停止反應，迅速冷卻至常溫，稱其質量，保持質量恒定，低溫保存。所得樣品進行感官品評，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測定其分子質量分布曲線圖。

1.4.4 體系4-水蒸氣熱反應體系

將上述反應原料放入水蒸氣發生器中，設定溫度為(100±1)℃，并開始計時，分別選取30、50、70、90、110min停止反應，迅速冷卻至常溫，稱其質量，保持質量恒定，低溫保存。所得樣品進行感官品評，選出牛肉香味得分最高一組，用高效液相色譜測定其分子質量分布曲線圖。

1.5 分析方法

采用高效液相色譜分析柱對牛肉制備液的分子組成種類分子質量分布及含量進行測定，分析條件：柱溫38℃，C18色譜柱：40mm×125mm，流動相：V(甲醇)：V(乙腈)=1：2；檢測器：UV波長338nm；流速：1mL/min，檢測波長：254nm。根據標準蛋白質的出峰保留時間，峰面積和分子質量首先確定分子質量擬合曲線，然后根據擬合曲線，通過保留時間計算所測各蛋白質的分子質量及相對含量，這種計算程序已經輸入高效液相色譜分析程序，所以蛋白質分子質量分布及相對含量的結果直接輸出。

1.6 感官品評設計

感官測評后選中的每個樣品制作3次，混勻過膠體磨，然后對每一個樣品采用3位數字進行隨機編碼，每一組包括3個樣品，每一個樣品在50℃恒溫水浴鍋中恒溫一段時間，然后沖成體積分數1%，倒入一次性淺口塑料杯，在聞香室由嗅聞小組成員打分，每一個樣品被不同的成員嗅聞3次(包括品嘗)，根據得分取其平均值。得分采用60分制，即最高為60分，最低為0分，每10分為一個級別。感官嗅聞之后取得分在30及以上分之間的單因素范圍條件進行高效液相測定分子質量分布分析。其中嗅聞小組成員是由經過專門訓練的調香師或者反應工程師組成，總共13人。

2 結果與分析

2.1 酶解牛肉色譜圖

圖 1 酶解牛肉蛋白色譜圖Fig.1 Chromatogram of beef enzymatic protein

由圖1 可知，牛肉經過一段時間酶解后，大于10000D的蛋白類物質占0.29%(小于10.88min)，5000～9999D(10.88～16.09min)的蛋白類物質占73.21%，3000～4999D(16.09～19.93min)的蛋白類物質占12.92%，1000～2999D(19.93～28.18min)的蛋白類物質占13.58%，小于999D(大于28.19min)的蛋白類物質沒有，說明該牛肉經過酶解之后，牛肉蛋白的立體空間結構已經被破壞，2～10個分子的寡肽幾乎不存在，主要以多肽和寡聚肽的形式存在。

2.2 微波熱反應體系色譜圖

表 1 微波熱反應體系感官品評結果Table 1 Results of sensory analysis in microwave system

由表1可知，15min時所得牛肉風味較協調，有牛肉本味，烤味稍有增強，并無碳化和焦糊等不愉快風味，因而選取該樣品進行色譜分析，所得譜圖如圖2所示。

圖 2 牛肉酶解液在微波體系中分子質量分布色譜圖Fig.2 Molecular weight distribution chromatogram of beef enzymatic protein in microwave system

由圖2可知，牛肉酶解液在微波體系中反應后，大于10000D的蛋白類物質占6.45%，5000～9999D的蛋白類物質占2.97%，3000～4999D的蛋白類物質占81.98%，1000～2999D的蛋白類物質占8.43%，小于999D的蛋白類物質沒有。在該體系中，大于10000D的牛肉蛋白類物質含量升高，說明5000～9999D區間物質部分發生聚合作用。而3000～4999D的牛肉蛋白類物質明顯升高，5000～9999D區間物質發生強烈降解和分解作用。1000～2999D區間物質降低，說明部分發生聚合作用和Maillard反應，降解和分裂作用并不明顯。體現良好牛肉風味物質分布在1000～4999D之間，主要集中于3000～4999D區間。在酸水解和酶解的植物蛋白中，國外也有相關牛肉風味研究[16-17]，但是兩者明顯的區別在于反應底物差異性較大，所得牛肉風味的逼真性區別也很明顯。

2.3 高壓熱反應體系色譜圖

表 2 高壓熱反應體系感官品評結果Table 2 Results of sensory analysis in high pressure system

由表2可知，70min時所得牛肉風味較協調，有熟牛肉本味，整體肉味飽滿協調，沒有碳化、焦糊、銹金屬和熱反應的酸氣等不愉快風味，因而選取該樣品進行色譜分析。

圖 3 牛肉酶解液在高壓熱反應體系中反應后的分子質量分布圖譜Fig.3 Molecular weight distribution chromatogram of beef enzymatic protein in high pressure system

由圖3可知，肉酶解液在高壓熱反應體系中反應后大于10000D的蛋白類物質占60.87%，5000～9999D的蛋白類物質和小于999D的蛋白類物質沒有，3000～4999D的蛋白類物質占27.95%，1000～2999D的蛋白類物質占11.18%，在該體系中大于10000D的牛肉蛋白類物質明顯高于酶解牛肉，說明在該體系中聚合作用明顯增強，尤其是5000～9999D的多肽聚合作用強烈，部分該區間的牛肉酶解蛋白物質發生降解作用。該樣品烤香不明顯，主要體現純牛肉香氣和口感，說明該體系Maillard反應趨勢不明顯。

2.4 熱空氣流熱反應體系色譜圖

表 3 熱空氣流熱反應體系感官品評結果Table 3 Results of sensory analysis in the flow of hot air system

由表3可知，70min時所得牛肉風味飽滿協調，有干蒸牛肉干本味，稍有烤味，沒有碳化和焦糊等不愉快風味，因而選取該樣品進行色譜分析。

圖 4 牛肉酶解液在熱空氣流體系中反應后的分子質量分布圖譜Fig.4 Molecular weight distribution chromatogram of beef enzymatic protein in the fl ow of hot air system

由圖4可知，牛肉酶解液在熱空氣流體系中反應后，大于5000D和小于999D的蛋白類物質為0，3000～4999D的蛋白類物質占85.52%，1000～2999D的蛋白類物質占14.48%，說明在該體系中，分子質量大于5000D的牛肉酶解蛋白類物質主要發生降解和分解作用，而分子質量小于999D的牛肉酶解蛋白類物質的聚合作用似乎也不明顯。與葡萄糖的反應活性主要集中于1000～4999D的牛肉酶解蛋白類物質中，但是Maillard反應趨勢明顯弱于降解和分解作用。體現牛肉香氣和醇厚牛肉口感的活性物質主要分布于1000～4999D區間，主要集中于3000～4999D。該樣品稍微具有烤味。

2.5 水蒸氣熱反應體系色譜圖

表 4 水蒸氣熱反應體系感官品評結果Table 4 Results of sensory analysis in water vapor system

由表4可知，50min時所得牛肉風味突出而且協調飽滿，沒有生腥味，也無其他不愉快風味，因而選取該樣品進行色譜分析。

圖 5 牛肉酶解液在水蒸氣熱反應體系中反應后的分子質量分布圖譜Fig.5 Polymerization of tyrosine and ferulaic acid catalysis by POD

由圖5可知，牛肉酶解液在水蒸氣熱反應體系中反應后，大于10000D和小于999D的蛋白類物質為0，5000～9999D的蛋白類物質占0.48%，3000～4999D的蛋白類物質占80.67%，1000～2999D的蛋白類物質占18.85%，在該體系中牛肉風味物質的消長規律接近于熱空氣流能量場體系，主要作用方式是5000～9999D區間物質發生強烈降解和分解作用。3000～4999D區間物質降解和分解作用也比較顯著，因而1000～2999D區間的物質含量增高。Maillard反應在整個區間都不明顯。體現良好牛肉風味物質主要分布在1000～4999D。

3 結 論

經過一定程度水解的牛肉蛋白質，分子質量分布主要在5000～9999D的寡肽和多肽形式存在的牛肉蛋白質，運用不同加熱方式，與葡萄糖進行熱反應的活性存在差異，因而形成的牛肉風味也存在差異。不同熱處理方法的熱反應體系中，牛肉酶解蛋白類物質發生變化的方式不同，主要是降解和分解作用、聚合作用，而Maillard反應作用方式不太顯著，這可能與分子質量大小和分子反應活性有關。體現牛肉風味物質分布于1000～4999D區間，主要集中于3000～4999D之間。在這個區間的牛肉酶解液與葡萄糖在高壓，熱空氣流和水蒸氣熱處理方式作用下形成的牛肉風味物質烤香不明顯，主要體現良好的牛肉味，無其他不良風味。

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