黃酒釀造過程細菌群落結構變化初步研究

欒同青，李志軍，鐘其頂，孟 鎮，熊正河，*，李 藝，李敬龍

（1.山東輕工業學院食品與生物工程學院，山東濟南250353；2.中國食品發酵工業研究院，北京100027；3.全國食品發酵標準化中心，北京100027；4.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

黃酒是中國的傳統酒種，其風味物質及有害物質的生成與發酵過程微生物菌群結構密切相關[1]。黃酒釀造過程微生物種類和數量繁多，細菌群落結構和相互作用機理復雜，以往的研究多是采用傳統平板對黃酒麥曲中的細菌進行分離并鑒定，不能快速、全面分析出細菌群落的整體結構，而與傳統方法相比，分子生物學技術在研究微生物多樣性方面具有明顯的優勢。近年來，很多學者利用PCR-DGGE技術對不同樣品進行了微生物多樣性分析，包括對土壤[2]、活性污泥[3-4]、大醬[5]、飲用水[6]、白酒大曲[7]、糟醅[8]、酒醅[9]和腸道菌群[10]等樣品的研究，結果表明，該技術在揭示環境微生物多樣性、種群差異等方面具有一定優越性。截至目前，尚未見采用PCR-DGGE技術研究黃酒釀造過程中細菌群落結構變化的報道，本文采用該技術初步研究了黃酒工業化生產條件下浸米水、麥曲和酒母及發酵過程中的細菌群落結構組成及變化情況，為進一步研究細菌對黃酒風味物質的影響和黃酒質量安全問題奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一個完整釀造流程中的浸米水、麥曲、酒母、前酵液（前酵第1、2、3、4d樣品）、后酵液（后酵第3、6、9、13、16d樣品） 浙江某黃酒廠；引物：F338GC/R518（F338GC：5’-CGCCCGGCCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGAGGCAGCAG-3’、下劃線部分為GC夾、518R：5’-ATTACCGCGGCT GCTGG-3’）、F338/R518、M13F/M13R（M13F：5’-TG TAAAACGACGGCCAGT-3’、M13R：5’-CAGGAAACA GCTATGACC-3’、dNTPs、X-gal、IPTG 上海生工生物工程技術服務有限公司；TransTaqTM HiFi DNA Polymerase、DNA純化試劑盒、pEASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 北京全式金生物科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、SDS 北京全新拓達科技有限公司；去離子甲酰胺、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基二乙胺 Sigma公司。

恒溫生化培養箱 上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機 Sigma公司；梯度PCR儀 Biometra公司；水平電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 Vilber lourmat公司；變性梯度凝膠電泳儀 Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

分別稱取3g浸米水、麥曲、酒母、前酵液（1、2、3、4d）和后酵液（3、6、9、13、16d）樣品，采取文獻[11]方法提取本實驗樣品基因組DNA。采用降落PCR法對提取DNA的16S rDNA V3區進行擴增，擴增產物進行DGGE實驗，最后進行連接轉化，送交測序公司測序。

2 結果與分析

2.1 DGGE圖譜分析

圖1為黃酒釀造過程不同樣品的細菌DGGE圖譜。DGGE電泳圖譜中不同位置的條帶代表了不同種屬的細菌；條帶的亮度反映了該細菌的豐度，條帶越亮，表明該細菌的相對含量可能越大。由圖1可以看出，各樣品的電泳條帶分離效果較好，條帶亮度各有不同，A、C、D、G為所有樣品共有條帶；浸米水樣品D條帶代表的細菌含量相對最豐富，并含有其他樣品不存在的細菌I和細菌J；麥曲樣品條帶較為繁雜，條帶G和K代表的細菌含量相對豐富；酒母與前酵液樣品條帶較相似；后酵液各階段樣品條帶較相似，且D、E、F條帶代表的細菌含量隨發酵時間呈逐漸升高趨勢。細菌G存在于黃酒釀造全過程，是發酵過程中的主要優勢菌。圖1顯示，發酵液樣品中至少含有14個清晰條帶，這表明在發酵過程中存在較高的細菌多樣性。圖2為黃酒釀造過程不同樣品之間細菌群落結構組成的相似度。由圖2可以看出，前酵樣品之間較為相似，后酵樣品之間較為相似，前酵樣品與后酵樣品之間存在較大差異，相似度僅為58%。

圖1 黃酒釀造過程細菌DGGE圖譜Fig.1 The DGGE profile of the bacteria during the rice wine fermentation process

圖2 黃酒釀造過程不同樣品間細菌群落結構組成的相似度Fig.2 The similarity of bacterial community structure between different samples during the rice wine fermentation process

為進一步分析黃酒釀造過程細菌群落結構變化，利用Quantity one等軟件對DGGE圖譜進行Shannon指數（H’）分析，評估樣品中細菌的多樣性；微生物區系菌群均勻度（E）分析，評估某一樣品中各細菌分布的均勻情況，結果見表1。

由圖1和表1可以看出，黃酒釀造過程細菌的多樣性隨著釀造時間的延續呈現先升高，而后逐漸穩定的趨勢，細菌種類增加，細菌總量分布趨于均勻。浸米水中細菌多樣性相對較低，細菌總量分布不均，D條帶代表的細菌總量較為豐富；麥曲和酒母的細菌多樣性較為復雜；前酵過程細菌多樣性基本呈現上升趨勢，細菌種類在逐漸增加，但均勻度變化不大；后酵開始階段細菌種類較多，而后呈現平穩趨勢。

表1 黃酒釀造過程細菌群落結構分析Table 1 Analysis of the changes of bacterial community structure during the rice wine fermentation process

2.2 釀造過程細菌群落多樣性分析

為進一步探明黃酒釀造過程細菌群落結構的多樣性，對DGGE圖譜中的條帶進行切膠回收、克隆轉化、藍白斑篩選和陽性克隆驗證等一系列操作后進行測序，將測序得到的目的序列，通過NCBI進行同源性搜索以及相關信息檢索，與數據庫中已有序列進行比對。結果顯示，黃酒釀造過程中存在乳桿菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、布丘氏菌（Buttiauxella）和不可培養細菌（Uncultured bacterium）等種類，見表2。此結果與張中華等[12]檢測的黃酒麥曲中的細菌群落結構相似，都檢測到含有Saccharopolyspora和Enterobacteriaceae，此外還檢測到了Lactobacillus和Staphylococcus，但未檢測出致病菌Clavibacter michiganensis；本實驗檢測出三株乳桿菌，與章銀珠等[13]運用傳統培養基法在黃酒中檢測出較多的乳酸桿菌結果相似。由圖1可見，Lactobacillus pentosus strain和Saccharopolyspora sp.由麥曲帶入發酵液，且在后酵階段含量較為豐富，Lactobacillus coryniformis strain由酒母帶入發酵液，且在前酵階段含量相對豐富。在黃酒發酵過程中含有較多的乳酸菌A、B、E，并檢測到了不可培養細菌F、G、J，其中，不可培養菌G還是發酵過程中的優勢菌群。

黃酒的釀造流程分為浸米、蒸米、攤涼、前酵、后酵和過濾煎酒等過程，麥曲和酒母在大米攤涼后與原料一起進入發酵過程。黃酒釀造過程細菌的多樣性呈現先上升后平穩的趨勢，原因可能是前酵過程發酵溫度高（26～34℃）、營養物質和氧氣充足、酒精度相對較低（由0°增長至14°左右），適宜微生物的大量繁殖；后酵過程實行控溫發酵，發酵溫度低（15℃左右）、酒精度較高（后酵結束增長至17°左右）、pH偏低（3.0～4.0），大部分微生物的繁殖受到抑制[14-16]。Lactobacillus plantarum strain（A）、Staphylococcus sp.（C）和Enterobacteriaceae bacterium（D）等屬于需氧或兼性厭氧菌，前酵過程的發酵條件適宜它們的生長，在大量繁殖后進入后酵過程而趨于平穩。Lactobacillus pentosus strain（B）等屬于厭氧型細菌，且具有較強的耐酸能力，其在后酵過程含量較為豐富。Saccharopolyspora sp.（K）等菌在前酵過程含量較為平穩，進入后酵過程后，其含量逐漸降低，可能是后酵過程的低溫、高酒精度和低pH導致了它們的衰退。

研究表明，在黃酒釀造過程中乳桿菌（Lactobacillus）可以產生乳桿菌素，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、假單胞菌和黃曲霉具有一定的抑制作用[17-18]，何煜波等[19]對Lactobacillus plantarum的基本性狀進行了研究，結果表明該菌對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有一定的抑制作用；祝嫦巍等[20]對Lactobacillus pentosus研究發現，其不僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用，而且對沙門氏菌等革蘭氏陰性菌也有一定的抑制作用；陳堅等[21]篩選出一株抑制生物胺產生的Lactobacillus coryniformis，該菌產生的細菌素具有較廣的抑菌譜。糖多孢菌（Saccharopolyspora）是尋找新的生物活性物質的重要菌源，某些種能產生重要的生物活性物質，如抗生素、酶類、維生素等，紅色糖多孢菌具有產紅霉素的能力[22]。布丘氏菌（Buttiauxella izardii）具有產植酸酶的能力，2009年丹尼斯科美國公司公布了一種可以應用于植酸酶工業生產的布丘氏菌[23]。

圖3 系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree

表2 DGGE條帶序列分析Table 2 Sequence analysis of DGGE bands

用軟件MEGA5對測序結果和GenBank中相關種屬代表菌株的16S rDNA序列構建系統進化樹，結果如圖3所示。由圖3可以看出A、B、C三種菌的親緣關系較近，D、E、I、J四種菌的親緣關系較近，H、K兩種菌的親緣關系較近，不可培養菌F、G與其他菌的親緣關系較遠。

3 結論

本文采用PCR-DGGE技術對黃酒釀造過程的浸米水、麥曲、酒母、前酵液和后酵液進行分析，以研究黃酒釀造過程細菌群落結構的變化。研究結果顯示，黃酒釀造過程細菌的多樣性呈現先上升后平穩的趨勢，原因可能與黃酒釀造過程不同階段的環境條件有關。浸米水細菌群落結構相對簡單，麥曲細菌群落結構較為復雜，前酵樣品與后酵樣品之間細菌群落結構存在較大差異，相似度僅為58%。

黃酒釀造過程中存在乳桿菌（Lactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）、布丘氏菌（Buttiauxella）和不可培養細菌（Uncultured bacterium）等種類。浸米水中存在獨有的Buttiauxella和Uncultured bacterium；麥曲中Saccharopolyspora含量豐富；前酵和后酵樣品中Enterobacteriaceae和Uncultured bacterium含量相對豐富。

本研究從黃酒釀造過程中檢出多株乳桿菌，說明乳桿菌對黃酒的發酵具有相對較大的影響，此外還檢出了不可培養的優勢菌，其在黃酒釀造過程中的作用有待進一步研究和驗證。

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