表面活性劑與β-環化糊精共同作用對放線菌羥基化維生素D3的影響

王國盼，蘇宏飛，+，韋春葵，熊思馳，黃 飛，李 麗，黃時海，*

（1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005；2.南寧高新區，廣西南寧530007）

維生素D3羥基化成活性形式如1α羥基維生素D3、25羥基維生素D3和1α，25位二羥基維生素D3才能發揮生理活性[1]。研究發現活性維生素D3可調節細胞繁殖和分化[2]。活性維生素D3廣泛應用于一些疾病的臨床治療[3]。許多絲狀真菌及放線菌具有甾醇羥基化能力，該羥基化作用主要由P450酶催化[4]。微生物的P450和電子傳遞鏈相關的蛋白大都在于細胞質或細胞質膜，屬于胞內酶。因此發酵往往受到細胞壁和細胞膜的影響。維生素D3并非P450羥化酶的天然底物[5]，因此研究作用于細胞膜、細胞壁和底物的物質對于微生物羥基化甾醇和維生素D3具有重要意義。近年來，β-環糊精與表面活性劑等在水溶液中的相互作用對于生命科學相關的囊泡形成以及蛋白質分子折疊有重要影響[6]。水相中β-環糊精與表面活性劑的相互作用主要是前者的憎水性分子內孔容納后者的疏水性基團形成包合物[7]。有些表面活性劑通透性，活化微生物細胞膜并促進底物、產物的傳遞和運輸，從而影響物質代謝和細胞生長。Fu jii Y等[5]研究證明，β-環糊精能提高25位羥化維生素D3產率。前期實驗中紫外誘變選育獲得了一株產維生素D羥化酶的放線菌CXX-10突變株。其所產羥化酶為胞內酶，若直接用菌體轉化反應，細胞壁及細胞膜會阻礙底物及產物在細胞內外的交換，羥基化產率較低。因此尋找一種既能使產羥化酶菌株細胞膜活化，又不與維生素D3競爭包容于β-環糊精的表面活性劑，對共同發揮兩者的促發酵優勢是必要和可行的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

放線菌CXX-10突變株 廣西大學生命科學與技術學院食品與發酵工程研究所保藏保存；維生素D3、25羥基維生素D3、β-環化糊精 Sigma公司；表面活性劑 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑 為國產分析純；ISP2固體培養基[8]葡萄糖10g，酵母膏10g，麥芽汁10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.5；種子培養基 可溶性淀粉20g，K2HPO41g，KNO30.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2；發酵培養基 蔗糖10g，魚粉10g，K2HPO41g，KNO30.5g，NaCl 1g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水1000mL，pH6.0～8.5。

LC-10AVP型高效液相色譜儀 日本島津公司；移液槍 日本立洋公司；電子分析天平 MEITLER公司；YP1200電子天平 上海精科有限公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養 將ISP2培養基斜面上的單菌落接種到裝有玻璃珠的種子培養基中，28℃，180r/min振蕩培養72h作為種子液。

1.2.2 25-羥基維生素D3含量的測定 按照改進的Bligh-Dyer[9]方法制備得到粗品。粗品溶解于乙腈，HPLC檢測25-（OH）D3含量[10]。產率計算公式：產率=液相檢測濃度×濃縮液體積/樣品總體積。

1.2.3 表面活性劑和環化糊精最佳組合的選擇 以50mL/250mL的發酵液/三角瓶裝液量，將培養好的種子液按3%接種量接入帶有玻璃珠的發酵培養液中，28℃，180r/min振蕩培養72h。添加乙醇溶解的終濃度為0.1mg/mL的維生素D3，實驗組一：同時添加濃度為0.02%的各種表面活性劑或者只添加0.5% β-環化糊精，其他條件不變的情況下發酵。實驗組二：同時添加濃度為0.02%的各種表面活性劑和0.5% β-環化糊精，其他條件不變的情況下發酵。空白對照組：不添加表面活性劑和β-環化糊精。每個因素做3個平行實驗，28℃，180r/min，發酵轉化96h。測定25-羥基維生素D3含量。

1.2.4 菌絲體干重的測定 以50mL/250mL的裝液量，接入0.25mL出發菌株的孢子懸浮液于帶有玻璃珠的濃度為0.02%不同表面活性劑的菌絲培養液中，28℃，180r/min振蕩培養96h。用蒸餾水將菌絲體沖洗3次后真空抽濾，將抽濾好的菌絲體置于65℃的烘箱烘干至恒重，用電子天平稱其重量。

1.2.5 表面活性劑和環化糊精較佳組合的發酵條件優化 根據上述實驗，選取較佳的表面活性劑和環化糊精組合，優化添加濃度、發酵溫度、pH、培養時間和添加時間等條件，研究其對羥基化產物產率的影響。

2 結果與討論

2.1 表面活性劑和環化糊精較佳組合的選擇

由圖1可知，Tween-80和Glycein（甘油）單獨作用可提高25-羥基維生素D3的產率，Triton-100、SDS和CTAB可抑制25-羥基維生素D3的生成。β-環化糊精單獨作用也可提高25-羥基維生素D3的產率。表面活性劑Tween-80、甘油與β-環化糊精共同作用能較大程度地提高25-羥基維生素D3的產率。依據實驗結果，可選擇Tween-80和β-環化糊精組合做進一步研究。

圖1 表面活性劑和β-環糊精對25-（OH）VD3產率的影響Fig.1 Effect of various surfactants and β-CD on productivity of 25-（OH）VD3

對于實驗結果，分析認為：放線菌CXX-10細胞壁受到一些表面活性劑的影響變得松弛，如Tween-80和Glycein，從而有利于底物維生素D3到達細胞膜并通過協助擴散進入細胞質。表面活性劑一般來說具有活化細胞膜的作用，但有些表面活性劑可能也會過度損傷細胞膜，抑制菌體的生長，不利于酶的生成[11]。進一步研究各種表面活性劑對菌體生長的影響。β-環化糊精與維生素D3形成復合物，有利于維生素D3溶于發酵液，從而增大細胞與維生素D3接觸幾率。另外β-環化糊精與維生素D3形成復合物有可能使維生素D3構象發生變化，形成的復合物能更好地結合到羥化酶結合位點[5]。此外，其他可能的原因是β-環化糊精疏水性的內腔可包容產物25-（OH）D3，從而間接降低代謝產物積累，減少羥基化產物對羥基化酶的反饋抑制作用，從而有利于產物的合成。而Tween-80、甘油與β-環化糊精共同作用，可能綜合提高了維生素D3溶解度、運輸和酶作用效率等，增加羥基維生素D3產率的效果更加明顯。依據實驗結果，可選擇Tween-80和β-環化糊精組合做進一步研究。

2.2 表面活性劑對菌體生長的影響

有些表面活性劑通透性，活化微生物細胞膜并促進底物、產物的傳遞和運輸，從而影響物質代謝和細胞生長。各種表面活性劑對CXX-10突變菌株生長的影響表1所示。

由表1可知，Tween-80和Glycein對菌體的生長影響不大，SDS、CTAB和Triton-100對菌體的生長影響大，抑制菌體的生長。因此選擇合適的表面活性劑對羥化菌株的生產很重要。

表1 Tween-80和β-環化糊精濃度對菌體生長的影響Table 1 Effect of β-CD and Tween-80 on mycelia growth

2.3 添加表面活性劑Tween-80和β-環化糊精較適濃度

由表2可知，固定Tween-80的濃度不變，在0.5%～1.5%范圍內，25-（OH）VD3產率隨β-CD濃度的增高而降低；固定β-CD的濃度不變，在0.02%～0.06%范圍內，25-（OH）D3產率隨Tween-80濃度的變化先升高后降低；同時添加β-CD和Tween-80的較適濃度分別為0.5%和0.04%。在此條件下25-（OH）D3產率達14.0mg/L。

表2 Tween80和β-環化糊精濃度對25-（OH）D3產率的影響Table 2 Effect of β-CD and Tween-80 density on productivity of 25-（OH）D3

2.4 發酵溫度對25-（OH）D3產率的影響

設置不同溫度的搖床，其他條件不變的情況下，添加乙醇溶解的維生素D3，同時添加0.04% Tween-80和0.5% β-環化糊精進行實驗對照，轉化培養96h后，提取產物檢測。如圖2所示，添加或者不添加表面活性劑Tween-80和β-環化糊精的較適溫度均為28℃。其可能原因是羥化酶是蛋白酶，隨著溫度升高酶活增高，達到最適溫度后，蛋白酶開始因溫度升高慢慢失活，造成酶活降低。

2.5 pH對25-（OH）D3產率的影響

根據上述實驗得出的較適條件，配制不同pH的發酵液，以不添加Tween-80和β-環化糊精為對照組，其他條件不變，轉化反應完成后提取產物檢測。結果如圖3所示，添加、不添加表面活性劑Tween-80和β-環化糊精的較適pH都為7.0。可能的原因是羥化酶是蛋白酶，溶液的pH會影響底物的解離狀態，影響底物與酶的結合。

圖3 pH對25（OH）D3產率的影響Fig.3 Effect of pH value on productivity of 25（OH）D3

2.6 發酵轉化時間對25-（OH）D3產率的影響

在以上優化條件的基礎上，以不添加Tween-80和β-環化糊精為對照組，分別在發酵3、5、7、9、11d后取樣，提取產物檢測。如圖4所示，添加表面活性劑Tween-80和β-環化糊精后，25-（OH）D3產率隨發酵時間的延長而提高，但發酵7d后產率不再增加。對照組在7d時產率最大，隨后有所回落。有可能β-環化糊精包容產物，使其不容易變質，所以在產率最高發酵時間7d后，產物沒有明顯的降低。而空白對照組在產率最高發酵時間7d后，產物有明顯下降趨勢。但考慮到發酵工藝要求，較適發酵時間以7d為宜。

圖4 發酵時間對產率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on productivity

2.7 表面活性劑Tween-80和β-環化糊精添加時間對產率的影響

圖5 Tween-80和β-CD添加時間對產率的影響Fig.5 Effect of addition time of Tween-80 and β-CD on productivity

在以上優化條件的基礎上，保持其他條件不變，以不添加Tween-80和β-環化糊精為對照組，分別在培養0、1、2、3、4、5、6、7d時添加Tween-80、β-環化糊精和VD3，發酵轉化至第8d后提取產物檢測。如圖5可知，實驗組在培養3d時添加，產物25-（OH）D3產率最高，達到了14.5mg/L；對照組也是在第3d時添加VD3合適，過早或延后均不利于菌體的羥基化能力。可能的原因是3d時菌體處在對數生長期，菌體較多，酶活較高，反應時間充足。

3 結果與討論

通過研究表面活性劑、β-環化糊精及其共同作用對放線菌CXX-10誘變菌株羥基化維生素D3的影響，選擇了促進作用較明顯的Tween-80和β-環化糊精組合，25-（OH）D3的產率達14.0mg/L左右。并優化其使用濃度、作用溫度、pH、轉化和添加時間等反應條件：培養3d后添加0.04% Tween-80、0.5% β-環化糊精和VD3，pH為7.0，28℃，180r/min，發酵轉化反應7d。在此條件下，25-（OH）D3產率達14.5mg/L，約為未添加Tween-80和β-環化糊精的對照組的300%，顯著提高了該菌株的羥基化效率。

利用微生物轉化維生素D3生產活性維生素D3具有條件溫和、污染少、提純方便等優勢，但由于菌體酶活力、底物的溶解性和細胞膜壁等限制，效率不高，現階段與實際應用尚有一段距離。而通過添加表面活性劑Tween-80以促進菌體膜壁運輸、β-環化糊精與底物形成復合物，探討發酵條件等方面，是一種有效的選擇。而有表面活性劑和β-環化糊精單獨和共同作用的機理也尚未清楚，有必要進一步做詳細研究。

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