基于金槍魚K值變化的MTT快速傳感器的研究及響應面設計

奚春蕊，包海蓉，劉 琴，繆函霖

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

金槍魚是大洋暖水性洄游魚類，肌肉強勁，肉質柔軟鮮美，蛋白質含量高，氨基酸配合優越，富含DHA、EPA等具有生物活性的多不飽和脂肪酸，是國際營養協會推薦的綠色無污染健康美食[1]。為了維持金槍魚的優良品質，魚從海上捕獲直至人們的餐桌上，需放置在-50℃的低溫條件下冷凍保藏[2]。在加工過程中，通常以生魚片的加工方式來維持金槍魚的品質、營養和風味。為了維持金槍魚的優良品質，魚從海上捕獲直至人們的餐桌上，需放置在-50℃的低溫條件下冷凍保藏[2]。然而根據日式料理店的現場調研發現，料理店對生魚片的貯存、解凍，再加工的具體驟操作模糊，沒有良好的溫度控制，對原料不同階段的新鮮度和判斷生食依據僅僅局限在傳統的感官檢測，不能系統準確地了解生魚片的品質情況。傳統的品質指標包括pH、持水力、感官評價等都不能較準確的反應生魚片在冷藏過程中的品質下降程度。通過這一技術的開發可以在各個環節的節點進行快速檢測，方便企業品控人員以及質檢機構及時了解產品品質。近年來已對一般魚肉鮮度快速評價有所研究，主要在微生物、揮發性物質、ATP降解產物等，快速檢測方法包括圖像分析、色差測量、近紅外光譜測量、揮發性物質測量、物性（質地）分析[3-8]。國內外專家就生物傳感器在魚肉鮮度檢測方面的研究也日益深入。干寧等[9]通過安培法檢測，利用三種以二茂鐵甲酸（FCA）為媒介體的導電聚吡咯酶電極，分別固定黃嘌呤氧化酶（XO）、核苷磷酸化酶（NP）和核苷酸酶（NT），定量檢測HX、INO、IMP，用來檢測淡水魚的鮮度。Hirokazu Okuma[10]以及Youko Nanjyo等[11]國外學者又在氧電極后連接轉換器和計算機，實現了自動化數據處理。普通的快速檢測方法，對于金槍魚等品質變化極快的生魚片無法準確快速的檢測，同時由于復雜設備受限，一般快速檢測方法無法運用于普通消費者。其次生魚片原料成本價格昂貴，一般傳統檢測取樣量大，而造成不同的經濟效益損失。因此研究一種快速的無損傷的品質檢測方法尤為重要。本研究基于金槍魚在低溫貯藏過程中K值變化，以黃嘌呤氧化酶（XOD）、MTT噻唑藍及Hx黃嘌呤的反應，通過反應產物的濃度及顏色變化與K值的變化建立相關性，采用響應面的實驗方法，對MTT傳感器的反應條件進行優化，建立能夠與K值變化基本相同的反應模型。通過傳感器顏色即可快速準確評價金槍魚的品質。為金槍魚下游消費的品質控制提供理論依據和快速檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃鰭金槍魚 中水集團遠洋股份有限公司，于斐濟島捕獲后直接凍藏-60℃冷庫中，將-60℃凍存的魚肉，體積約120mm×63mm×18mm（長×寬×厚），用零度3%的冰鹽水浸漬，形成冰衣后置于4℃冷藏室，直至完全解凍，每隔4h取出魚樣測定K值；甲醇 色譜純；高氯酸、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水乙醇、鹽酸、Tris-Base 分析純，國藥上海公司提供；ATP關聯物：5’-腺苷三磷酸二鈉鹽，高純（98%）、5’-腺苷二磷酸二鈉鹽，高純（98%）、5’-腺苷一磷酸二鈉鹽，高純（95%）、5’-肌苷一磷酸二鈉鹽，超純（99%）、肌苷，超純（99%）、黃嘌呤，高純（98%） 上海楷洋生物技術有限公司；黃嘌呤氧化酶，BR 90U/mg 500U 上海源葉生物技術有限公司；噻唑藍（MTT）Sigma公司。

冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；XHF-1組織粉碎機 上海金達生化儀器；LC-10AT高效液相色譜、SPD-10A紫外檢測器 日本島津；紫外分光光度計（T6世紀） 北京普析通用；低溫恒溫箱 上海一恒科學儀器有限公司；pH計SG2、電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 K值測定方法

ATP及其降解產物的提取和測定主要參考文獻[12]，稍作調整，精確稱量約5g魚肉，加10% PCA（高氯酸）溶液15mL均質，冷凍離心機4℃3000r/min離心3min，上清液用濾紙過濾，濾液再加入5% PCA（高氯酸）溶液10mL均質，冷凍離心機4℃3000r/min離心3min，上清液再次過濾，重復上述操作2次，過濾后用10mol/L KOH和1mol/L KOH調整濾液pH至6.35～6.4之間，用去離子水定容至50mL，上述溶液用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，于-50℃下用小離心管凍藏，解凍后用于HPLC測定，整個過程冰浴操作，并保持環境溫度在4℃左右。

HPLC條件[13]：使用紫外檢測器，流速1.0mL/min，進樣量10μL，檢出波長260nm。色譜柱：ZORBAX SBC18（250mm×46mm×5μm），流動相：0.07mol/L KH2PO4：0.03mol/L K2HPO4（V∶V=1∶1，pH6.45），采用外標法定量。

1.3 噻唑藍MTT傳感器

1.3.1 緩沖溶液的選擇 將2.5mL 含2mg 噻唑藍（MTT）的90%乙醇-1mol/L的Tris-HCl緩沖液，和2mL含2mg黃嘌呤（Hx）的相同緩沖液混合于比色管中，混勻，使藥品充分溶解后，加入0.4U的黃嘌呤氧化酶（XOD）。

HCL調節90%乙醇-1mol/L的Tris-HCl緩沖液緩沖溶液pH分別為7.4、7.6、7.8、8.0、8.2，24h后在565nm處測定吸光度。確定傳感器緩沖溶液最適pH。

1.3.2 單因素實驗

1.3.2.1 噻唑藍（MTT）添加量 將2mL含有2mg黃嘌呤（Hx）、pH為7.8的緩沖溶液與2.5mL分別含1、1.5、2、2.5、3mg的MTT相同緩沖溶液混合均勻，加入0.4當量的黃嘌呤氧化酶（XOD），置于4℃冷藏室中，經歷魚樣相同的時間，每隔4h，取出在565nm處測得吸光度。測得傳感器吸光度的變化與K值的變化進行配對檢驗及相關性分析。

1.3.2.2 Hx含量 將2mL分別含有1、1.5、2、2.5、3mg黃嘌呤（Hx）、pH為7.8的緩沖溶液與2.5mL分別含2mg噻唑藍（MTT）相同緩沖溶液混合均勻，加入0.4當量的黃嘌呤氧化酶（XOD），測定方法同MTT單因素實驗。

1.3.2.2 XOD添加量 將2.5mL含2mg噻唑藍（MTT）的緩沖液，和2mL含2mg黃嘌呤（Hx）的相同緩沖液混勻，分別加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6U的黃嘌呤氧化酶（XOD）。測定方法同MTT單因素實驗。

1.3.3 傳感器實驗方法與設計

1.3.3.1 MTT傳感器設計 MTT[3-（4，5-dimethylthiazo-l2-yl）-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide]噻唑藍是一種四唑鹽，活細胞線粒體呼吸鏈上的脫氫酶（如：琥珀酸脫氫酶和心肌黃酶等）能將黃色的噻唑藍還（MTT）原成藍紫色的甲臜（FMZ），且FMZ生成量與活細胞量成正比[14]。其反應式如下：

圖1 MTT在酶作用下的反應過程Fig.1 MTT reaction equation by enzymes

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）簡稱XOD（EC.1232），是生物體內核酸代謝過程中的重要酶類[15]。黃嘌呤氧化酶廣泛存在于動物的組織中，是一種氧化還原酶類，可以把黃嘌呤、次黃嘌呤氧化成尿酸；把脂肪族、芳香族醛氧化成羧酸；還能氧化嘧啶類、嘌呤類、蝶啶類物質及NADPH。

黃嘌呤氧化酶可把次黃嘌呤、黃嘌呤氧化成尿酸，當有嘌呤存在時，催化反應表現為底物的羥基化，而醛則被氧化成羧酸，見圖2[16]。

MTT傳感器是基于XOD酶的作用下有Hx和MTT進行反應生成FMZ含量隨時間溫度變化而發生改變，通過吸光度的測試來反應實驗過程。

圖2 酶催化反應方程Fig.2 Enzyme catalytic reaction equation

1.3.3.2 傳感器實驗方法 根據單因素實驗，采用Minitab 16軟件建立Box-Behnken模型，實驗因素水平編碼見表1。實驗以XOD添加量、Hx含量和MTT含量為因素，以傳感器反應化學產物FMZ生成速率，即反應體系顏色變化，通過測得反應體系的吸光度與相同條件下K值進行的計算相關性，以相關性為響應值，對數據進行統計分析。蔡智澄等[17]在相關性分析原理中提出相關系數，它是由英國統計學家卡爾·皮爾遜提出的，其數學表達式為：

式中，X和Y為兩個待研究變量。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平編碼Table 1 Factors，levels and coding table of Box-Behnken design test

1.4 實驗數據處理

實驗進行三次平行實驗，使用Origin 8.0、Minitab 16、Excel 2007軟件分析計算。

2 結果與討論

2.1 4℃冷藏條件下金槍魚K值變化

ATP分解過程中，以HxR和Hx濃度的總和與ATP關聯物濃度的總和的比值，即為K值。是魚肉鮮度的重要指標，就金槍魚而言，當K值小于20%，即為良好鮮度的金槍魚，當K值大于50%時，達到保鮮的最大上限。K值可有效反映魚體在僵硬期至自溶期的不同鮮度。

金槍魚在4℃冷藏過程中，隨著時間的延長魚肉中肌苷和黃嘌呤的含量不斷增加，K值也不斷上升，經過解凍后的初始K值為6.512，經過32h后變化為20.111，上升至初始值的三倍。當K值在20%以下時，金槍魚魚肉的品質能夠達到生產生魚片的優良等級，因此以K值20%為生食終點為標準[18]。4℃貯藏終點約為32h左右。同時根據一級動力學方程A=A0×e-kt[19-20]，計算出K值變化的速率常數為0.1463。

圖3 金槍魚K值4℃冷藏期間的變化Fig.3 Changes in K value in Tuna during storage at 4℃

2.2 MTT傳感器研究與響應面優化

在MTT化學傳感器中，由于黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下，在生成尿酸的同時產生呼吸鏈上的脫氫酶，還原黃色噻唑藍，生成藍紫色的甲臜（FMZ），通過測定吸光度來確定生成甲臜（FMZ）的含量，通過傳感器顏色表征為從黃色變為藍紫色，FMZ含量越高，傳感器顏色越深[21-22]。通過吸光度的顏色變化與相同條件下K值變化進行相關分析，即可確定傳感器的各項條件，間接的評價金槍魚的品質。

2.2.1 pH對MTT傳感器的影響 黃嘌呤氧化酶XOD的等電點是5.3～5.4，最適pH在8.3左右，當pH在酸性范圍內時，酶活性隨pH的下降而降低，當pH高于10.15時，則酶活性隨pH 的升高而急劇下降[23]。而MTT水溶液在pH7.0以下穩定，3～5周內不變性，在pH7.0以上溶液中不太穩定。因此考察了pH對傳感器緩沖液的影響[21]。

傳感器4℃環境下，不同pH緩沖液，放置24h測得吸光度值見圖4。

圖4 不同pH緩沖液MTT傳感器吸光度值Fig.4 Absorbance value of MTT sensor at different pH

根據圖4可以看到，在pH在8.2的緩沖溶液中，MTT傳感器的吸光度最大，且通過統計分析各pH的吸光度有極顯著性差異（p＜0.01）。這可能是因為XOD對pH的敏感程度大于MTT，MTT在24h內，緩沖體系較穩定。pH緩沖體系的pH較接近XOD的最適pH。因此固定MTT傳感器緩沖液體系的pH為8.2。

2.2.2 單因素實驗與K值的相關性結果

2.2.2.1 Hx含量單因素結果 表2為Hx含量對傳感器吸光度與K值相關性的影響，可以看出不同Hx的添加量對傳感器吸光度的變化與同樣條件下K值變化具有相關性差異。添加量為2.5mg的水平數時，相關系數最大，同時不同的Hx添加量反應過程基本符合一級反應動力學模型，其中2.5mg的水平數對K值擬合程度最高。因此可以確定Hx含量的水平數為2、2.5、3mg。

表2 Hx含量對傳感器吸光度與K值相關性的影響Table 2 Effect of Hx content on the correlation between sensor absorbance and K value

2.2.2.2 MTT含量單因素結果 表3為MTT含量對傳感器吸光度與K值相關性的影響，與Hx含量對傳感器吸光度對K值變化相同，同樣具有顯著相關性，且不同的添加量相關性差異顯著。其中2mg的水平數，相關系數最大，從擬合系數看，最符合一級反應動力學模型，同時從表3中可以看出，高濃度的MTT含量的擬合度要明顯高于低濃度的MTT含量。因此確定MTT含量的水平數為2、2.5、3mg。

表3 MTT含量對傳感器吸光度與K值相關性的影響Table 3 Effect of MTT content on the correlation between sensor absorbance and K value

2.2.2.3 XOD添加量單因素結果 表4為XOD添加量對反應體系吸光度與K值相關性的影響。不同當量的XOD對反應體系吸光度與K值變化的相關性有顯著影響。添加量為0.2U的相關系數最大，但與一級反應動力學模型的擬合程度不高，與K值變化規律不符。因此確定XOD添加量的水平數位0.3、0.4、0.5U。

表4 XOD添加量對傳感器吸光度與K值相關性的影響Table 4 Effect of XOD content on the correlation between sensor absorbance and K value

2.2.3 響應面法優化MTT傳感器結果 根據Box-Behnken實驗設計原理，用XOD含量X1、Hx含量X2、XOD添加量X3，3個因素水平進行實驗，表5為響應面實驗設計與實驗結果[24]。

表5 響應面法設計與實驗結果Table 5 Design and experimental results of RSM

采用Box-Behnken對金槍魚K值變化與MTT傳感器吸光度變化相關性進行MTT傳感器各因素水平進行優化，考察MTT含量、Hx含量、XOD添加量對相關性的影響，進行了12個分析因實驗和3個中心實驗，表5給出各實驗的數據。對響應值與各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程：

對模型式（2）進行方差分析和回歸系數顯著性檢驗，結果見表6。方差分析表明，該二次響應面模型F值為7.23＞F0.05（9，4）=6.00，p＜0.05，表明所選用的二次多項式模型具有顯著性（p＜0.05）。失擬項F值＜F0.05（9，3）=8.81，p=0.105＞0.05，表明失擬不顯著?；貧w模型的確定系數R2=0.9287，說明該模型能解釋92.87%響應面的變化，該模型的擬合程度良好，實驗誤差較小。因此可以用該模型對MTT傳感器吸光度變化與K值變化的相關性進行分析和預測。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis for the regression model

系數顯著性檢驗可知，如果模型檢驗項p值小于0.05，則該項是顯著的，否則該項不顯著，因此由表6可知：一次項X1（p=0.015）、X3（p=0.026）顯著，即XOD添加量和MTT含量對相關性結果有顯著影響，二次項X22（p=0.002）顯著，交互項均不顯著。根據模型各因素的回歸系數式（1）絕對值大小，可以得到各因素的對傳感器吸光度與K值變化的相關性影響的主次順序為：X1＞X3＞X2，即XOD黃嘌呤氧化酶的添加量＞MTT噻唑藍的含量＞Hx黃嘌呤的含量。

2.2.4 MTT傳感器吸光度變化與K值變化相關性最優條件的確定及模型驗證 根據回歸方程，得到各因素交互作用的響應面圖和等高線圖如圖5～圖7。從響應曲面的最高點可以看出，在所選范圍內存在極值，響應面的最高點同時也是等值線最小橢圓的中心點，由圖5～圖7可知，該回歸方程存在穩定點，即有極大值點，與方差分析的結果一致。

圖5 XOD添加量、Hx含量對K值和傳感器吸光度變化相關系數的曲面圖Fig.5 Surface of mutual-influence of XOD content and Hx content on the correlation between sensor absorbance and K value

圖6 XOD添加量、MTT含量對K值和傳感器吸光度變化相關系數的曲面圖Fig.6 Surface of mutual-influence of XOD content and MTT content on the correlation between sensor absorbance and K value

圖7 Hx含量、MTT含量對K值和傳感器吸光度變化相關系數的曲面圖Fig.7 Surface of mutual-influence of Hx content and MTT content on the correlation between sensor absorbance and K value

用Minitab軟件通過對回歸方程模型進行優化求解，得到MTT傳感器最優條件參數為X1=0.7980，XOD的添加量為0.4798U，X2=-0.1111，Hx 的含量為2.4445mg，X3=0.5152，MTT含量為2.7576mg，此時得到最大相關性值為0.9924?？紤]到實際可操作性，將三個值進行修正：XOD添加量為0.5U，Hx含量2.4mg，MTT的含量為2.77mg，進行三次驗證實驗，相關系數平均值為0.9882，相對誤差0.42%，與理論計算值基本吻合。因此，利用響應面法得到的MTT傳感器的最優條件與K值變化相關性最高。

3 結論

基于金槍魚在冷藏過程中K值的變化，以MTT噻唑藍、Hx黃嘌呤、XOD黃嘌呤氧化酶的反應所研發的K值即鮮度的的化學傳感器，在冷藏溫度為4℃，K值終點為20%時，研究了時間、K值變化與傳感器吸光值的相關性。

3.1 金槍魚在4℃冷藏過程中，隨著時間的延長魚肉中肌苷和黃嘌呤的含量不斷增加，K值也不斷上升，32h后K值為21.111，達到貯藏終點。

3.2 根據響應面Box-Behnken實驗設計理論進行MTT傳感器吸光度和K值變化相關性的實驗結果表明二次響應面模型擬合度較高，適合于對MTT傳感器條件的優化，使其余K值變化的相關性提高。得到的優化結果為：XOD添加量為0.5U，Hx含量2.4mg，MTT的含量為2.77mg。

3.3 通過實驗分析MTT傳感器在冷藏條件下吸光度的變化，與相同條件下金槍魚K值的變化具有很大的相關性，相關系數均在0.9以上，因此該傳感器可以運用于對于金槍魚品質鮮度的快速檢測。

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