甲胺磷生物降解酶對韭菜中農殘生物修復效果研究1）

張娜，郭慶啟，劉曉飛，黃文秀，宋琨，王雙，李爽

（1.哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076；2.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040）

甲胺磷農藥（MAP）殺蟲譜廣，毒性大，制作工藝簡單，曾是我國使用量最大的農藥品種，由于其生產和使用對環境和人體可能造成巨大的污染［1］，國家已經禁止生產使用該農藥。但是，甲胺磷農藥屢禁不止，2007年重慶多種蔬菜中發現甲胺磷農藥，2012年8月蘇州生菜中發現甲胺磷農殘超標，2007年在煙臺，2012年在青島分別發現千余噸含有甲胺磷農殘的毒韭菜［2－4］如何從根本上安全而有效的消除甲胺磷農殘的危害，是近年來眾多科研人員所關注的［5－7］。本研究利用實驗室分離得到的一株微生物代謝產生甲胺磷農藥降解酶（MAPE），利用該酶液對在生長過程中噴灑甲胺磷農藥的毒韭菜進行分析，優化降解工作參數，為甲胺磷農殘的有效去除奠定了科研基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 供試菌株

實驗室中分離得到XY－C菌株，該菌株為葡萄球菌屬（Staphylococcus Rosehbach）［8］。

1.1.2 實驗儀器

SPX－70B型搖床振蕩培養箱，天津泰斯特儀器有限公司；722型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SYQ－DSX－280A型不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；101型電熱鼓風干燥箱，東聯電子技術開發有限公司。

1.1.3 實驗材料

甲胺磷農藥：產自鄭州蘭博爾科技有限公司；規格為300g／500mL；有效成分為40%。甲胺磷標準品：上海農藥研究所提供。其余試劑均為分析純。種植時噴灑甲胺磷農藥的韭菜為實驗性原料，購于黑龍江省富?？h。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的組成

無機鹽培養基：NaCl 0.5g，MgCl20.5g，K2SO40.5g，CaCl20.1g，FeSO40.01g，MnSO40.001g，蒸餾水1000mL，pH7.0滅菌后，再加入0.5mL甲胺磷農藥。

1.2.2 粗酶液的提取

將實驗室分離出來的降解甲胺磷農藥的菌株XY－C，接種于無機鹽培養基，在28℃，180r／min的搖床中振蕩培養72h后將液體培養基4000r／min離心處理，取上清液，即為粗酶液。

1.2.3 甲胺磷含量的測定

待測樣品經過前處理后，精確稱取待測樣品的分解液2mL，以試劑空白作參比，其余操作步驟同標準曲線。測其吸光度值，計算出磷的含量，再根據計算出來的總磷和無機磷的量，用兩者之差算出樣品中有機磷的含量［9］。

1.2.4 降解率公式

式中：m1—酶液反應時間為零時所測得的無機磷含量，mg／L；m2—酶液與韭菜反應后測定的無機磷含量，mg／L；d—韭菜中甲胺磷農殘的降解率，%；x—韭菜中有機磷的含量，mg／L；y—韭菜中總磷的含量，mg／L。

1.2.5 韭菜中甲胺磷農殘生物降解工藝參數的確定

每隔一段時間在韭菜表面噴灑不同體積的的粗酶液，于不同溫度下存放不同時間后，分別依照不同處理，取回樣品，去掉非可食部分，用濾紙擦凈蔬菜表面的泥沙，用刀切碎，混勻。用電子天平準確稱取10g樣品，加入10mL水用組織搗碎機切碎充分混合、打漿，每個樣品打3份原漿，用于平行試驗，進行總磷和無機磷測定，并計算甲胺磷農殘的降解率［10］。

2 結果與討論

在吸光度740nm時，通過比色法測定無機磷和總磷含量。吸光值與磷含量呈現一定的線性關系，所得的方程為y（吸光值）＝0.1247x（無機磷濃度，mg／L）＋0.0088，R2＝0.9995。說明無機磷標準溶液濃度同吸光值之間線性關系良好，該方程可以用于測定韭菜中無機磷的含量。

2.1 噴灑次數對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

圖1 噴灑次數對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

對在種植過程中噴灑了甲胺磷農藥的韭菜在其成熟后，每隔30min噴灑一次甲胺磷農藥降解酶液10mL，于室溫下反應，對噴灑酶液的韭菜進行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農藥降解率，結果如圖1所示。隨著噴灑次數的增多，韭菜中甲胺磷農殘降解率不斷升高，在韭菜表面噴灑1次粗酶液對韭菜中的甲胺磷農殘的降解率為31.41±1.01%，而在韭菜表面噴灑5次粗酶液后，韭菜中的甲胺磷農殘的降解率提高為66.33±0.50%，在噴灑3次之后，這種降解率提高的情況出現減慢趨勢，因此，選擇甲胺磷降解酶對韭菜的噴灑次數為3次。

2.2 粗酶液使用量對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

圖2 MAPE使用量對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

對在種植過程中噴灑了甲胺磷農藥的韭菜在其成熟后，噴灑甲胺磷農藥降解酶，均噴灑3次，每100g韭菜上每次噴灑5～25mL，于室溫下反應，對噴灑酶液的韭菜進行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農藥降解率，結果如圖2所示。

隨著甲胺磷農藥降解酶使用量的增多，韭菜中甲胺磷農殘降解率不斷升高，在韭菜表面噴灑3次每次5mL的粗酶液對韭菜中的甲胺磷農殘的降解率為30.97±1.70%；而在韭菜表面噴灑3次每次25mL的粗酶液后，韭菜中的甲胺磷農殘的降解率提高為64.74±0.76%；在噴灑每次20mL的粗酶液后，雖然降解率在逐漸升高，但是降解率升高并不是十分明顯。從實驗數據可以看出在不同的酶液添加量的反應體系中，底物濃度不變的情況下，在酶液添加量較少時，降解率隨著酶液添加量的增加而增加，降解速率也較快，兩者呈正比關系；隨著酶液添加量進一步的增加，降解率有小幅度的增加，降解速率明顯下降，這可能與底物中酶含量過多，底物與酶中心迅速結合，導致酶活性受抑有關。因此，選擇20mL甲胺磷降解酶對100g韭菜進行噴灑降解。

2.3 作用溫度對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

對種植過程中噴灑了甲胺磷農藥的韭菜在其成熟后，噴灑甲胺磷農藥降解酶，于不同溫度下反應，對噴灑酶液的韭菜進行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農藥降解率，結果如圖3所示。

圖3 溫度對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

隨著作用溫度由4℃不斷增加到65℃，韭菜中甲胺磷農殘降解率出現先升高后降低的變化趨勢，在45℃對韭菜中甲胺磷農殘進行降解時的降解率為64.63±1.25%，比4℃和65℃作用環境下，韭菜中的甲胺磷農殘的降解率分別提高6.4倍和1.67倍。因此，選擇45℃進行甲胺磷降解酶對100g韭菜進行噴灑降解。

2.4 作用時間對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

對種植過程中噴灑了甲胺磷農藥的韭菜在其成熟后，噴灑甲胺磷農藥降解酶，反應不同時間后對噴灑酶液的韭菜進行粉碎、脫色，測定甲胺磷含量并計算甲胺磷農藥降解率，結果如圖4所示。

圖4 作用時間對韭菜中甲胺磷農殘的降解效果的影響

隨著作用時間的增多，韭菜中甲胺磷農殘降解率不斷升高，在作用20min后，甲胺磷農殘降解率增加并不顯著，反應30min后甲胺磷農殘的降解率為67.17±1.17%，比反應20min時甲胺磷農殘的降解率僅提高了2.5%。而反應20min后甲胺磷農殘的降解率為64.63±1.25%，比反應15min和反應5min時甲胺磷農殘的降解率分別提高4.3%和10.1%。因此，選擇20min作為反應時間，進行甲胺磷降解酶對100g韭菜的降解。采用單因素試驗得到的各工藝參數噴灑三次每次20mL的甲胺磷農藥降解酶于45℃反應20min，得到的甲胺磷農殘降解率高達68.74±0.86%。

3 結論

采用單因素試驗得到的各工藝參數，噴灑3次，每次20mL的甲胺磷農藥降解酶于45℃反應20min，得到的韭菜中甲胺磷農殘降解率高達67.17±1.17%。

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