胚齡、激素對小麥單倍體萌發率及成苗率的影響

孫蘇陽， 王永軍， 李海軍， 李麗麗， 蔣學祥

(江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所，中國農業科學院矮敗小麥育種技術創新中心＜淮安＞，江蘇 淮安 223001)

常規的小麥品種選育，一般需要5～8年才能形成農藝性狀相對整齊一致的穩定群體。如果進行遠緣雜交，由于雜種后代瘋狂分離，則品種純化需要更長的時間。小麥單倍體育種是將單倍體染色體加倍獲得純合雙單倍體。通常雙單倍體在一個世代中就可以得到純合的重組體，這對于縮短小麥品種育種年限，提高育種效率很有意義。

自1964年人們經過花藥離體培養獲得單倍體后，應用單倍體技術進行品種改良迅速發展。但對于普通小麥而言，這種產生單倍體的方法，不僅成苗率低，而且會產生大量的白化苗。1975年Barely［1］用普通小麥與球莖大麥雜交獲得了高頻率的小麥單倍體，但后來的研究表明普通小麥與球莖大麥之間的雜交存在不親和性，并已證明這種不親和性是由于位于小麥5B染色體長臂上的Kr1基因和5A染色體長臂上的Kr2基因有阻止小麥與異源植物交配的功能，從而限制了該法在小麥育種上的應用。1984年德國學者Zenkteler［2］最早報道了玉米花粉誘導小麥獲得球形胚的研究結果，但無細胞學證明。1986年Laurie等［3］進行了詳細的細胞學觀察，證明了小麥與玉米雜交后，在最初的3次細胞分裂中，來自父本玉米的染色體被完全排除掉，形成了僅有21條母本小麥染色體的單倍體胚。進一步研究表明，小麥×玉米的受精頻率不受小麥所攜帶的Kr1、Kr2基因的影響，說明Kr基因在小麥與玉米雜交中是不敏感的［4］。1988年，Laurie等［5］利用小穗培養法獲得了小麥×玉米產生的單倍體植株。因此利用小麥×玉米誘導單倍體是一種有效的單倍體育種方法。

適宜的胚齡對幼胚的培養十分重要，而不同的學者對此研究結果不盡相同［6-8］，胚齡從11～16 d不等。呂國鋒等［6］在用1/2MS培養基培養幼胚時不添加任何激素，而蔡黎明［9］研究認為在1/2MS培養基中添加0.2 mg/L IAA及0.2 mg/L 6-BAP的培養效果較不添加激素的效果好。本試驗擬通過研究不同胚齡以及1/2MS培養基中激素的有無對幼胚萌發率和成苗率的影響，以期確定本地區適宜幼胚離體培養的最佳胚齡及培養基，使這種單倍體育種方法最大程度地發揮其作用。

1 材料與方法

1.1 材料

父本玉米花粉供體為江南花糯和蜜玉1號兩個雜交種的混合花粉。母本為(西農979×淮麥18)F1、(西農979×淮麥24)F1、(小偃6號×淮麥19)F1、(小偃6號×淮麥24)F1和太谷核不育小麥的6種不育株后代。小麥于2011年10月10日播種，玉米在塑料大棚內分5期播種，分別為2011年12月4日、12月24日，2012年1月14日、2月8日和2月21日，以調節小麥和玉米的花期。胚齡以玉米第1次授粉到剝取穎果的天數計。試驗在江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所試驗基地實施。

1.2 小麥與玉米雜交

小麥抽穗后對常規雜交種進行剪穎、去雄、套袋，對太谷核不育的不育株剪穎套袋。小麥開花時采集新鮮的玉米花粉給小麥逐花授粉，第1次授粉后24 h進行第2次重復授粉。2，4-D的處理參照姚景俠［10］的方法，第1次授粉24 h后向小麥柱頭上用微量噴霧器噴灑100 mg/kg的2，4-D溶液1.5 ml，48 h 后再次用 100 mg/kg的 2，4-D 溶液 1.5 ml處理一次。

1.3 幼胚離體培養

將玉米第1次授粉后13～20 d的雜交穗取回，小心剝取穎果。在超凈工作臺上先用70%酒精表面滅菌30 s，然后用0.1%的升汞滅菌10～15 min，無菌水沖洗3～4次，解剖鏡下剝取幼胚，接入培養基處理。培養基設2種不同處理:不添加任何激素的1/2 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8;1/2 MS+0.2 mg/L 6-BAP+0.2 mg/L IAA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8。25℃下暗培養，待幼胚萌發后置于20℃、16 h/d光照條件，大約14 d后觀察幼胚的萌發和成苗情況。

萌發率=(幼胚萌發數/接種胚數)×100%;成苗率=(成苗數/接種胚數)×100%。

2 結果

2.1 不同胚齡對單倍體萌發率及成苗率的影響

小麥單倍體胚齡為 15～19 d，萌發率從 74.4%～100.0%不等。從圖 1 可見，胚齡為 15 d、16 d、17 d、18 d、19 d的小麥單倍體幼胚平均萌發率分別為92.1%、93.8%、98.3%、94.1%和74.4%。小麥幼胚萌發率隨著胚齡的增加而相應提高，并在胚齡為17 d時達到最大，隨后下降，在胚齡為19 d時，萌發率最低。

圖1 胚齡對小麥單倍體幼胚萌發率的影響Fig.1 Effects of embryo age on germination rate of haploid from wheat×maize

胚齡為15～19 d的小麥幼胚成苗率從16.3% ～64.4%不等。由圖 2 可見，胚齡為 15 d、16 d、17 d、18 d、19 d 的小麥幼胚平均成苗率分別為51.3%、64.4%、62.4%、20.1%和16.3%。可見，小麥幼胚成苗率隨著胚齡的增加相應提高，并在16 d時達到最大，隨后，成苗率開始下降但較為緩慢，胚齡為17 d后，成苗率急劇下降。

圖2 胚齡對小麥單倍體幼胚成苗率的影響Fig.2 Effects of embryo age on seedling rate of haploid from wheat×maize

2.2 激素對幼胚萌發及成苗的影響

胚齡同為16 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌發率分別為 100.0%、92.8%，成苗率分別為71.5%、78.6%;胚齡同為17 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌發率同為100.0%，成苗率分別為60.0%、71.4%;胚齡同為18 d的不育株材料，添加激素和不添加激素后胚的萌發率分別為82.1%、100.0%，成苗率分別為6.8%、33.3%。表明，培養基中沒有添加激素的不育株成苗率較添加的高，但添加激素與否對萌發率的影響結果不一致。

3 討論

胚齡的大小對幼胚的離體培養十分重要。從本研究可以看出，胚齡從15 d到17 d，隨著胚齡的增加其胚的萌發率提高，此后開始下降，至19 d時萌發率最低;成苗率在胚齡為16 d時達到最大，從17 d時開始急劇下降，這一結果基本與呂國鋒等人［6］的研究相同。可見，胚齡為16 d時，其萌發率和成苗率較高，是較為合適的幼胚培養時期。

蔡黎明［9］研究認為，1/2MS培養基中添加 0.2 mg/L IAA和0.2 mg/L 6-BAP的培養效果較不添加激素的效果好，但本試驗的結果卻是不加激素的材料其成苗率較添加0.2 mg/L IAA和0.2 mg/L 6-BAP的成苗率高。IAA和6-BAP分別起促進生根及促使嫩芽分化的作用，如果濃度不適宜則起不到作用。從本試驗結果來看，0.2 mg/L可能不是最適宜小麥單倍體胚的激素濃度才導致其成苗率不如不添加激素的效果好，因此關于適宜的激素濃度還有待于進一步的研究。

［1］BARELY I R.High frequencies of haploid production in wheat by chromosome［J］.Nature，1975，256:410-411.

［2］ZENKTELER M，NITZSCHE W.Wide hybridization experiments in cereals［J］.Theor Appl Genet，1984，68:311-315.

［3］LAURIE D A.Wheat × maize hybridization［J］.Can J Genet Cytol，1986，28:313-316.

［4］LAURIE D A，BENNET M D.The production of haploid wheat plants from wheat× maize crosses［J］.Theor Appl Genet，1988，78:393-397.

［5］LAURIE D A，BENNET M D.The effect of the crossability of Kr1 and Kr2 on fertilization frequency in bihaploid wheat×maize crosses［J］.Theor Appl Genet，1987，73:403-409.

［6］呂國鋒，范金萍，高德榮，等，胚齡對小麥×玉米單倍體植株產生的影響［J］.江蘇農業學報，2003，19(1):59-60.

［7］陳新民，陳 孝，徐惠君，等.利用小麥與玉米雜交產生小麥單倍體的研究［C］//莊巧生，杜振華.中國小麥育種研究進展(1991 ～1995).北京:中國農業出版社，1997:510-518.

［8］末永一博.與玉米雜交獲得小麥雙單倍體系統的方法［J］.國外農學——麥類作物，1991(4):29-31.

［9］蔡黎明.小麥單倍體幼胚離體培養研究［J］.中國農學通報，2006，22(7):313-315.

［10］姚景俠，李浩兵，鐘少斌，等.小麥與玉米雜交及單倍體的產生［J］.植物學通報，1995，12(3):31-35.