不結球白菜抗根腫病基因的分子標記

張 慧， 徐 海，， 況媛媛， 宋 波， 陳龍正， 袁希漢

(1.南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014)

不結球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)起源于中國，在全國各地區尤其是南方廣泛栽培，是國內重要的綠葉菜之一［1］。根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一種世界性病害，可導致十字花科作物根和莖吸收傳導養分受阻，生長不良，萎蔫、矮化，產量和質量受損，以致減產，造成巨大經濟損失［2-3］。近年來，由于不結球白菜栽培效益好，復種指數高，土傳病害逐漸成為制約不結球白菜發展的重要因素，根腫病由過去不常見的病害逐漸顯露出來，并呈蔓延趨勢。

目前，抗根腫病分子標記研究主要集中在結球白菜和甘藍上，在這些研究中，分別利用RAPD及RFLP等標記確定了與抗性有關的QTL［4］。在結球白菜上已經對抗根腫病基因位點進行了定位和基因圖譜的繪制。抗性遺傳研究發現，不同的生理小種抗性遺傳機制不同［5］。甘藍苗期根腫病抗性遺傳規律結果表明，抗病性受3對以上基因控制，為不完全隱性［6］;而一些研究結果表明B.napus的根腫病抗性是由1～2個獨立的顯性基因所控制，這些顯性基因在大量抗性材料中都存在［7-9］。

由于不結球白菜根腫病為土傳病害，不易控制，目前關于不結球白菜根腫病方面的研究鮮有報道。因此開發抗根腫病特異分子標記，對提高育種效率及開展分子標記輔助育種具有重要意義。本研究利用引自結球白菜根腫病抗源，與不結球白菜進行亞種間雜交，構建分離群體，試圖篩選出抗根腫病特異分子標記，并鑒別回交后代材料的根腫病抗性，為分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2010年，從韓國園藝研究所引進1份結球白菜抗根腫病材料，其對根腫病表現為高抗。利用江蘇省農業科學院蔬菜研究所十字花科項目組不結球白菜研究材料T青做父本進行轉育，得到F1代。2011年春，將雙親及F1代種植于江蘇省農業科學院蔬菜研究所實驗田。對F1代植株進行自交，得到F2代，F1代單株與不結球白菜親本回交，得到BC1代。田間管理按常規方法進行。

1.2 方法

1.2.1 各世代植株抗性鑒定 供試材料:T青、結球白菜抗源 CR、F1、F2及 BC1。每個材料3次重復，每次重復30株，隨機排列，播種于50孔穴盤。

待苗長到3～4片真葉時移栽營養缽，采用灌根法進行抗性鑒定。用移液器吸取1 ml含5×107或1×108個孢子懸浮液10 ml，澆注到寄主根際周圍，接菌6周后，洗凈根部泥土，調查單株發病情況，并計算病情指數。田間病情分級參考前人研究分級標準［3］，略有改動。分級標準為:0級，未發生病害;1級，根系的須根、側根有較少細小腫瘤，主根未發生病害;2級，根系的須根腫瘤多，側根腫瘤較多，主根發病較輕，微微腫大;3級，根系的主根發病較重，異常腫大，大部分須根、側根腫瘤多;4級，根系的主根異常腫大，根系幾乎無須根。0級為抗病，其他均為感病。

1.2.2 DNA提取與檢測 采用CTAB法提取幼嫩葉片DNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用紫外分光光度計檢測DNA質量和濃度，并稀釋至 15 ng/μl。

1.2.3 抗感池的構建及引物篩選 采用BSA法，在F2群體中分別隨機選取10株抗病單株和10株感病單株，將其DNA等量混合，構建抗病基因池和感病基因池，對引物進行篩選，挑選在抗、感病池間能夠產生特異性條帶的引物。

1.2.4 PCR反應體系及反應程序 ISSR反應體系的總體積為20 μl，包括1 ×PCR buffer，模板 DNA 30 ng，Taq 酶 1 U、dNTP 250.00 μmol/L、引物 0.25 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L。

ISSR反應程序為94℃預變性5 min;94℃變性1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，循環35次;72℃延伸10 min，擴增產物4℃保存。

1.2.5 瓊脂糖電泳分離 反應結束后，PCR產物點入含0.5 μg/ml EB的2.0% 瓊脂糖凝膠中，以DNA marker V(Tiangen)作為分子量標準，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，紫外凝膠成像儀下照相。

1.2.6 ISSR標記的連鎖分析 將篩選出的 ISSR標記在雙親及F2分離群體中進行驗證，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。親本為抗病有標記帶和感病無標記帶，F1代為感病有標記帶，F2代中重組型個體為抗病無標記帶、雜合感病無標記帶和純合感病有標記帶，根據F2代中重組型單株的數量計算交換率，再根據Kosambi作圖函數公式換算成Morgan遺傳距離。

2 結果

2.1 抗根腫病群體抗性鑒定

表1 親本、F1、F2和BC1群體對根腫病的抗性Table 1 Resistance to clubroot in parental lines，F1，F2and BC1

2.2 分子標記的篩選

用90條ISSR引物進行親本PCR擴增，其中21條ISSR引物可以在親本間穩定擴增出清晰多態性條帶，占總引物數的23.0%。將能夠擴增到清晰多態性條帶的引物在抗感池中篩選，結果發現，引物873(5'-GACAGACAGACAGACA-3')可以在抗感基因池中擴增出多態性條帶，差異片段分別約為500 bp(圖1)。

圖1 引物873對親本和抗感DNA池的PCR電泳圖譜Fig.1 The electrophoresis pattern of parents and DNA pools by primer 873

由于抗根腫病基因是顯性基因，如果標記與抗病基因緊密連鎖，純合抗病株和雜合抗病株都能擴增出此帶，而純合感病株應沒有此帶。利用F2分離群體中的73個單株DNA對候選引物進一步驗證，結果(圖2)顯示，標記873在54份高抗根腫病單株(抗性0級)中，53個擴增出差異條帶，1個未擴增出差異條帶。同樣19份感病單株中，有6份擴增產生特異條帶。因此共有7株在標記873與抗病基因之間發生重組，交換率為9.59%。依據Kogambi作圖函數公式得出標記873與抗根腫病基因之間的遺傳距離為9.72 cM，命名為CR-873。

圖2 引物873對F2部分單株的擴增圖譜Fig.2 The PCR pattern of individuals of F2by primer 873

3 討論

根腫病抗性(Clubroot resistance，CR)的遺傳機制研究主要集中在白菜、甘藍、甘藍型油菜這3類蕓薹屬作物中。Laurens等認為，甘藍的根腫病抗性由許多主效的等位基因所控制，這些等位基因是不完全顯性的，并具有明顯的加性遺傳效應［10］。Voorrips等認為控制甘藍根腫病抗性的基因都是隱性基因［11］。在B.rapa中發現了至少3個主要的根腫病抗性基因，這些基因是相對獨立的，且分別對不同的P.brassicae 生理小種發生作用［12-14］。Diederichsen等利用ECD04和DH群體發現了B.napus根腫病抗性由1個主效基因和至少2個隱性基因控制［15］。王芳展等認為，B.rapa大多數抗性基因都來自于歐洲飼料蕪菁，不同的品種獲得了1個或者多個的抗性基因，而這些基因之間又相對保持獨立［16］。本研究通過對抗根腫病多世代群體進行抗性鑒定表明，不結球白菜抗性由顯性單基因控制。

Matsumoto等發現了2個RFLP標記與1個CR基因CRa連鎖，并將其定位在 R3染色體34 cM的位置上［17］。Suwabe等利用 SSR標記，發現了Crr1和Crr2 2個CR位點［18］。Kuginuki等利用Siloga作為抗源，發現了3個RAPD標記與CR位點連鎖［19］。ISSR技術可以比RFLP、SSR、RAPD等技術更多地揭示基因組中的多態性，并比RAPD穩定，比AFLP簡便，是一種很好的DNA指紋標記。本研究采用BSA和ISSR技術相結合來研究與不結球白菜抗根腫病基因連鎖的標記，得到1個與根腫病抗性基因連鎖較緊密的分子標記CR-873，遺傳距離為9.72 cM。本研究中得到的CR-873標記與抗根腫病基因的遺傳距離仍然較遠，可能是因為本研究中用于計算遺傳距離的群體偏小，一定程度上影響遺傳距離的準確性。后續研究可以進一步擴大群體并把獲得的可能與抗根腫病基因相連鎖的ISSR標記轉換為更穩定的SCAR標記。

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