畢赤酵母表達人溶菌酶基因的初步研究

王安平， 朱善元， 王永娟， 吳 雙， 左偉勇， 洪偉鳴

(江蘇畜牧獸醫職業技術學院，江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300)

溶菌酶(LYZ)是1922年由英國科學家Fleming首先在人的唾沫、眼淚和鼻涕中發現的，因其可使細菌細胞壁溶解而得名［1］。它能切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯結，破壞肽聚糖支架，在內部滲透壓的作用下細胞脹裂開，引起細菌裂解，有些革蘭氏陰性菌也會受到溶菌酶的破壞。人和動物細胞無細胞壁結構亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體細胞無毒性作用［2］。

人溶菌酶(hLYZ)屬于c型溶菌酶，即雞卵清溶菌酶(cLYZ)，由130個氨基酸殘基組成，相對分子質量為14 700。參與機體的防御機制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調節的作用，具有潛在的臨床應用價值［3］。通常人溶菌酶是從人乳或胎盤中少量提取，由于來源困難，提取方法復雜，不能進行大規模工業化生產。采取DNA重組技術，從原核或真核表達系統生產人溶菌酶是解決其供需矛盾的有效途徑。畢赤酵母是目前最為成熟的真核表達系統之一，迄今為止已成功地表達了100多種外源蛋白質［4］。本研究通過基因工程手段，利用畢赤酵母系統表達具有生物活性且易于純化的人溶菌酶，為人溶菌酶的規模化開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 含人溶菌酶基因的真核表達質粒p215C3-LYZ、酵母表達載體pPIC9K和酵母株GS115由本實驗室保存;大腸桿菌TOP10感受態細胞由本實驗室制備和保存;微球菌由揚州大學醫學院微生物教研組提供。

1.1.2 酶和試劑 Prime STAR HS DNA高保真聚合酶、限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ及DNA連接酶購自大連寶生物公司;Wizard DNA純化試劑盒購自美國Promega公司;氨基糖甙類抗生素G418購自Americo公司;hLYZ單抗購自Abcam公司;其他試劑均為國產分析純級。

1.1.3 PCR引物合成 根據已發表的hLYZ(NM_000239)基因序列設計1對引物，并在其兩端分別引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點，其序列分別為:正向引物5'-GGTGAATTCAAGGTCTTTGAAAGGTGTG-3'和反向引物5'-GTTGCGGCCGCCACTCCACAACCTTGAACA-3'。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hLYZ基因的獲得 以本實驗室保存的含人溶菌酶基因的重組質粒p215C3-LYZ為模板擴增人溶菌酶基因。反應條件為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，反應進行30個循環，72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按Wizard DNA Clean-up System試劑盒說明書進行純化回收目的基因。

1.2.2 畢赤酵母重組表達載體的構建 用限制性內切酶EcoR I和NotⅠ酶切回收的PCR產物，經凝膠電泳分離和回收后，與用同樣酶切線性化的畢赤酵母表達載體pPIC9K連接。連接產物轉化E.coli TOP10感受態細胞，在含100 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上37℃培養過夜后，挑取單菌落，提取質粒電泳篩選，并進行酶切鑒定。酶切鑒定正確后送由上海生工公司測序。

1.2.3 畢赤酵母宿主菌電轉化 用SacⅠ酶切線性化pPIC9K-LYZ質粒，純化回收并將其濃度調整為 1 μg/μl。將 10 μl pPIC9K-LYZ 與 80 μl GS115感受態細胞混合，1 500 V電擊5 ms;電擊后酵母細胞涂布于MD平板上，30℃靜置培養2～3 d，直至長出白色菌落。

1.2.4 重組酵母菌株高拷貝轉化子的篩選及甲醇利用型鑒定 無菌條件下，用96孔細胞培養板對陽性克隆進行連續傳代，使細胞濃度達到一致，充分懸浮細胞，用微量移液器吸取5 μl細胞懸液分別滴加于含 0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、0.75 mg/ml、1.00 mg/ml、1.50 mg/ml、2.00 mg/ml、3.00 mg/ml、4.00 mg/ml G418的YPD平板，30℃靜置培養2～5 d，篩選得到高拷貝克隆子。將篩選到的高拷貝克隆子分別接種MD和MM平板，30℃靜置培養3 d，如果兩種平板上均生長良好，則為Mut+型轉化菌，僅MD板上生長良好而MM板上生長較差的為Muts型轉化菌。

1.2.5 PCR檢測hLYZ基因與畢赤酵母染色體基因組的整合 按照Invitrogen公司提供的方法，提取高拷貝重組畢赤酵母菌總DNA，以通用引物5'-AOX和3'-AOX PCR法檢測hLYZ基因與畢赤酵母染色體基因組的整合，以pPIC9K空質粒轉化的畢赤酵母菌作陰性對照。

1.2.6 重組酵母菌株的誘導表達 取少量甘油保存的高拷貝GS115轉化子接種于5 ml YPD培養基中，200 r/min轉速30℃培養過夜;按1∶100的比例接種于BMGY培養基，200 r/min 30℃培養24 h;室溫下3 000 g離心5 min，收獲細胞沉淀，用1/4體積含0.5%甲醇的BMMY培養基誘導表達，為了增加通氣量，用紗布封口。每隔24 h取上清以備分析，并添加甲醇至終濃度為0.5%繼續誘導。

1.2.7 重組蛋白質的SDS-PAGE和Western blot鑒定 將高拷貝重組酵母菌株的誘導上清，用真空抽干機濃縮10倍，取10 μl作為樣品，與上樣緩沖液混合均勻，40℃孵育30 min，再60℃孵育10 min，最后煮沸2 min。電泳條件為:恒壓電泳，先40 V 1 h，當樣品進入分離膠時，電壓升至60 V約3 h。電泳完畢時，膠置于染色液中振蕩染色1.5～2.0 h，轉至脫色液中擴散脫色，直到背景清晰。

1.2.8 重組蛋白質抑菌活性測定 抑菌活性測定采用管碟法:取處于對數生長期的微球菌菌液15 μl稀釋于 150 μl滅菌水中，均勻涂布于 LB 瓊脂板表面，將直徑6 mm的無菌不銹鋼小管放在平板表面，于管內滴加樣品100 μl，以同體積的空載體pPIC9K轉化子的誘導上清為陰性對照，溶菌酶標準品為陽性對照，放置于37℃恒溫箱中，培養18 h后觀察結果。

2 結果

2.1 表達載體pPIC9K-LYZ的構建與鑒定

以重組質粒p215C3-LYZ為模板擴增出大小約400 bp左右的條帶，瓊脂糖凝膠電泳回收后，用EcoRⅠ及 NotⅠ進行酶切，與經同樣雙酶切的pPIC9K連接，獲得酵母表達重組載體pPIC9K-LYZ。Pst I酶切鑒定正確(圖1)，并且DNA測序證明LYZ基因克隆正確無突變。

圖1 酵母表達載體pPIC9K-LYZ酶切鑒定Fig.1 Identification of yeast expression vector pPIC9K-LYZ by endonuclease digestion

2.2 重組酵母菌株的篩選與鑒定

將pPIC9K-LYZ轉化的酵母菌重組菌在MD平板上培養，挑取單菌落接種于含YPD培養液的96孔板，3次傳代培養使細胞密度均勻一致，然后用含不同濃度G418的YPD平板篩選高拷貝轉化子，并用MD和MM平板鑒定其甲醇利用型，結果獲得抗4 mg/ml G418的高拷貝轉化子5株，且皆為Muts表型。以高拷貝重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-hLYZ基因組為模板的PCR擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1條大小約900 bp的條帶，而以重組畢赤酵母GS115/pPIC9K為模板的PCR產物未擴增出目的條帶(圖2)，說明hLYZ基因已經整合入GS115基因組中。

圖2 重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-hLYZ的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant Pichia pastoris GS115/pPIC9K-hLYZ by PCR

2.3 重組蛋白質hLYZ在畢赤酵母中的分泌表達

取0.5%甲醇誘導72 h的Muts型酵母菌表達上清濃縮10倍，取10 μl進行SDS-PAGE電泳分析，銀染后檢測到特異表達條帶，大小約為1.44×104，與理論值相符(圖3)，說明重組蛋白質hLYZ在畢赤酵母中成功表達。

圖3 重組蛋白質hLYZ的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

2.4 重組蛋白質hLYZ的抗菌活性

利用管碟法測定了誘導上清對溶壁微球菌的抑菌作用，結果顯示重組蛋白質hLYZ及溶菌酶標準品對溶壁微球菌均具有良好的抑菌效果，而空載體pPIC9K轉化子的誘導上清則沒有抑菌作用(圖4)。

圖4 重組蛋白質hLYZ抑菌活性測定Fig.4 Antibacterial assay of the recombinant protein hLYZ

3 討論

隨著人們對“無毒、無殘留、無耐藥性”新一代抗菌物質的認識，溶菌酶已成為研究熱點。溶菌酶廣泛存在于自然界動物、植物和微生物中。人們主要從雞蛋清中提取此酶。人溶菌酶(hLYZ)屬于c型溶菌酶，主要用于臨床治療，具有抗菌和抗腫瘤的作用。通常人溶菌酶是從人乳或胎盤中少量提取，由于來源少，提取方法復雜，不能進行大規模工業化生產［5-6］。

隨著基因工程技術的成熟，通過重組技術表達外源蛋白質成為可能。畢赤酵母表達系統是目前應用較為廣泛的第二代真核表達系統，該系統表達外源蛋白質具有基因操作簡單、外源蛋白質能正確加工與修飾、表達量高、易大量發酵培養、易純化等優點。畢赤酵母表達系統已成功表達多種外源蛋白質［7-11］，有些外源蛋白質如人血清白蛋白的表達量可達較高水平［12-13］。

本研究采用畢赤酵母表達系統，成功地分泌表達了具有抗菌活性的重組蛋白質hLYZ，SDS-PAGE試驗結果表明表達的重組蛋白質分子量正確，抑菌試驗進一步證實hLYZ具有良好的殺菌活性，為其大量生產從而開發新型抗菌藥物奠定了一定的基礎。但有關hLYZ表達水平、抗菌效力及作用機理等還需要進一步研究。

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