轉MYB基因小麥耐旱性的初步分析

周淼平， 周小青， 姚金保， 張增艷， 張 鵬， 楊學明， 馬鴻翔

(1.江蘇省農業科學院生物技術研究所，省農業生物學重點實驗室，江蘇 南京 210014;2.中國農業科學院作物科學研究所，北京100081)

MYB蛋白是植物中數量最多且功能最多樣化的轉錄因子家族，主要參與調控植物細胞周期、器官形態建成、次生代謝以及對逆境脅迫反應的應答，根據MYB結構域重復數的不同可將其劃分為MYB1R、R2R3-MYB、R1R2R3MYB以及4RMYB 等4類［1］。目前MYB基因及其功能在擬南芥、水稻和棉花等作物中已進行了廣泛研究［1-2］。小麥中MYB基因功能的研究相對滯后，目前發現的MYB基因多參與干旱和鹽害等非生物逆境脅迫反應。Chen等［3］克隆了23個MYB基因片段，但僅有6個得到完整開放閱讀框，用30%PEG處理后，6個MYB基因表達特性各不相同。Cai等［4］通過小麥EST序列電子克隆了36個R2R3-MYB型MYB基因。王轉等［5］從小麥水分脅迫誘導表達的cDNA文庫中檢測到2個MYB基因。利用TaMyb2基因特異引物，賈東升等［6］克隆了3種類型TaMyb2的cDNA序列，轉化擬南芥的結果表明，TaMYB2A基因可以抵御干旱、鹽以及冷害的脅迫［7］。Rahaie等［8］分析了 10 個MYB基因對鹽和干旱脅迫的應答，發現4個MYB基因在短期鹽脅迫后小麥根部表達上調，3個MYB基因在長期鹽脅迫后基因表達上調，其中TaMYBsdu1基因受長期干旱脅迫后在小麥的根和葉中顯著上調，可能是小麥對鹽和干旱脅迫應答的主要調節因子。Zhang等［9］克隆了60個小麥MYB基因并進行表達分析，發現過表達TaMYB32基因可提高轉基因擬南芥的耐鹽性。同樣TaMYB73在轉基因擬南芥中過表達也增加了對鹽脅迫的抵御［10］。這些研究表明，MYB在植物的抗旱耐鹽中具有重要作用。

中國農業科學院作物科學研究所根據擬南芥AtMYB108基因同源小麥EST序列克隆了小麥TaPIMP1基因，該基因具有典型的MYB基因特點。我們將該基因導入小麥揚麥158，發現轉基因株系的紋枯病抗性有所提高［11］。由于AtMYB108基因不僅參與擬南芥抗病性的調節，同時也參與擬南芥的抗逆反應，所以轉基因株系的抗旱耐鹽性有沒有提高值得關注。本研究擬采用轉基因純合株系，通過模擬干旱處理，對部分耐旱性狀指標進行初步分析，以探討該基因在小麥耐旱轉基因種質培育方面的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 轉基因材料

純合轉TaPIMP1基因小麥株系B64和B208以及轉基因受體對照揚麥158由本研究室保存。

1.2 模擬干旱對小麥TaPIMP1基因表達的影響

將揚麥158、B64和B208的1葉1心幼苗置于含20%(質量體積比)PEG6000的Hogland營養液中模擬干旱脅迫處理，分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、24 h各取5株葉片樣品，等量混合，液氮中磨碎，采用AxyPre RNA提取試劑盒(Promega公司)提取RNA，PrimeScript反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA。qRT-PCR采用SYBR@GreenI(TaKaRa公司)在LightCycler2.0熒光定量PCR儀(Roche公司)上進行，內參照基因采用actin基因，基因的相對表達量采用2-△△Ct法計算。TaPIMP1基因擴增引物為5'-ACGGACAACGAGGTCAAGAAC-3'和5'-GAAATGGGCTCCGTGCG-3';actin基因擴增引物為5'-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3'和5'-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3'。

1.3 模擬干旱對種子萌發和幼苗生長的影響

選取籽粒飽滿、大小一致的揚麥158、B64和B208種子，分別于無菌水和無菌水配置的20%(質量體積比)PEG6000溶液中浸泡12 h后，轉移至墊有濾紙的9 cm培養皿中，每皿50粒左右，置于25℃培養箱中黑暗萌發，3 d后計算發芽率。

選取在無菌水中萌發露白的揚麥158、B64和B208種子置于墊有濾紙的9 cm培養皿中，分別添加無菌水和20%(質量體積比)PEG6000溶液20 ml，于25℃、70%濕度的植物生長箱中培養7 d后，測量胚芽鞘長度、胚根長度，同時調查胚根數。

1.4 模擬干旱對相關生化指標的影響

取形態長勢一致的5葉期對照植株和轉基因株系植株，洗凈根部后置于1/2MS營養液中培養2 d，再移入含0、5%、10%、15%和20%(質量體積比)PEG6000的營養液中進行不同強度模擬干旱處理，12 h后測定葉片相對含水量、可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量以及過氧化物酶(POD)活性。

1.4.1 小麥葉片相對含水量的測定 參照Siddigue等［12］方法進行，計算公式為:相對含水量=(鮮質量－干質量)/(飽和質量－干質量)×100%。

葉片鮮質量在取樣后2 h內測定，將葉片于20℃蒸餾水中浸泡18 h后測定飽和質量，70℃烘箱中烘烤72 h后測定干質量。

1.4.2 葉片可溶性糖 按張志安等的方法［13］進行，取0.3 g葉片，置于10 ml蒸餾水中，沸水浴30 min，提取液過濾，并定容至25 ml。吸取0.5 ml提取液于試管中，依次加入蒸餾水1.5 ml、9%苯酚1.0 ml和濃硫酸5.0 ml，搖勻，室溫下放置30 min顯色，485 nm波長下測定光密度，計算可溶性糖含量。

1.4.3 葉片MDA含量 采用張志安等方法［13］，取1 g葉片，采用石英砂于2 ml 5%TCA中研磨至勻漿，加入8 ml 5%TCA進一步研磨，勻漿以4 000 r/min離心10 min，吸取上清 2 ml，加入 2 ml 0.6%TBA溶液，混勻，沸水浴10 min，3 000 r/min離心15 min，上清測定532 nm、600 nm、450 nm 處的吸光度值。提取樣品中 MDA濃度，由 C(μmol/L)=6.45(A532－A600)－0.56A450公式計算，根據樣品稀釋倍數換算成葉片中MDA含量。

1.4.4 葉片 POD活性 按張志安等方法［13］進行，取1 g葉片于研缽中，加適量磷酸緩沖液研成勻漿，4 000 r/min離心15 min，上清定容至100 ml;于比色杯中加入反應混合液3 ml和上述提取酶液1 ml，測量波長470 nm下的吸光度值，每隔1 min讀數1次。POD活性以1 min內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)。根據一定反應時間內吸光度的變化、取樣質量和提取液稀釋倍數計算POD活性。

1.5 統計分析

試驗獲得的數據采用SAS軟件進行顯著性分析。

2 結果

2.1 模擬干旱脅迫對小麥TaPIMP1基因表達的影響

PEG6000模擬干旱處理前，對照揚麥158的TaPIMP1基因有一定的本底表達，2個轉基因株系B208和B64的表達水平基本一致，明顯比揚麥158的表達水平高，主要是因為導入的TaPIMP1基因由玉米ubiquitin組成型啟動子驅動，在轉基因植株內維持了一定量的表達(圖1)。20%PEG6000處理時，對照和轉基因株系的TaPIMP1基因均經歷了明顯的先下調再逐漸上調的過程，處理24 h，轉基因株系B64的表達明顯高于B208和對照揚麥158。先前的研究表明，TaPIMP1基因表達與小麥水分虧缺相關，干旱處理后，小麥TaPIMP1基因表達明顯上調［14］。本研究模擬干旱處理采用的是1葉1心期的幼苗，是否由于生長時期的不同而導致TaPIMP1基因的表達方式產生一定的差異，有待進一步探討。但干旱處理引起TaPIMP1基因表達的劇烈波動，表明該基因與小麥的耐旱性有關聯。

圖1 模擬干旱處理后轉基因株系及其對照TaPIMP1基因的表達分析Fig.1 Expressions of TaPIMP1 gene in transgenic lines(B208 and B64)and control(Yangmai 158)after treatment of PEG6000 osmotic stress

2.2 模擬干旱脅迫對種子萌發和幼苗生長的影響

20%PEG6000脅迫處理后，對照揚麥158種子的萌發受到明顯抑制，發芽率由100%下降到68.5%;脅迫處理對轉基因株系的種子萌發影響較小，B64株系發芽率仍為100%，B208株系雖然由100%下降到83.3%，但仍然極顯著高于揚麥158，表明轉基因株系在種子萌發時期的耐旱能力比受體對照有所提高。

PEG6000脅迫處理對轉基因株系和受體對照幼苗的胚根數影響不明顯，但胚芽鞘和胚根的伸長受到嚴重抑制。2個轉基因株系胚芽鞘和胚根的伸長明顯好于對照揚麥158(表1)，表明轉基因株系幼苗對干旱的耐受能力優于揚麥158。

表1 PEG6000脅迫對轉基因株系和受體對照種子萌發后生長形態指標的影響Table 1 Effects of PEG6000 osmotic stress on seedling growth of transgenic plant(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.3 模擬干旱脅迫對葉片相對含水量的影響

采用不同濃度PEG6000模擬干旱脅迫處理12 h，發現轉基因株系B64和B208與對照揚麥158的表現不盡相同。在0～15%濃度下，對照和轉基因株系之間的表型變化差異不大，B64株系植株生長狀況稍好，但在20%的濃度下，受體對照揚麥158植株的萎蔫程度明顯比轉基因株系嚴重。

取模擬干旱處理后的小麥葉片，測定葉片相對含水量，發現5%低濃度處理時，轉基因株系與對照差異不明顯，10% ～20%濃度下，對照揚麥158葉片相對含水量明顯低于轉基因株系(表2)。植物組織含水量對植物的生理活動有重要影響，干旱的直接作用就是引起植物組織失水，導致各種代謝活動的生長紊亂，相對含水量是評價干旱脅迫程度的穩定參數［15］。轉基因株系葉片相對含水量明顯高于揚麥158，表明轉基因株系的耐旱性好于受體對照。

表2 轉基因小麥株系和受體對照葉片相對含水量比較Table 2 Comparison of relative water content in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.4 模擬干旱脅迫對葉片可溶性糖含量的影響

干旱脅迫下，植物體內的可溶性糖會大量積累，以緩解外界脅迫對植物造成的傷害［16-20］。由表3可以看出，當PEG6000濃度為5%時，轉基因株系B64和B208與對照揚麥158的可溶性糖含量差異不大;隨著PEG6000濃度的提高，轉基因株系與對照的可溶性糖含量都有增加趨勢;當濃度達到10%時，轉基因株系與對照的可溶性糖含量差異達到顯著水平;當濃度達到20%時，轉基因B64株系和B208株系的可溶性糖含量比未干旱脅迫處理分別增加了1.43倍和1.29倍，對照植株增加1.04倍，轉基因B64株系和B208株系的可溶性糖含量分別是對照揚麥158的1.47倍和1.29倍，顯示轉基因株系對干旱脅迫的緩解能力有所提升。

表3 轉基因小麥株系和受體對照葉片可溶性糖含量比較Table 3 Comparison of soluble sugar in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.5 模擬干旱脅迫對葉片MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的最終產物，是膜系統受傷害的重要標志之一，其含量可以表示膜脂過氧化作用的程度。由表4可以看出，不同濃度PEG6000脅迫下，轉基因株系B64和B208和對照揚麥158的葉片MDA含量均呈增加趨勢，表明干旱脅迫對受試株系的膜系統造成了傷害，并且濃度愈高傷害愈重。5%PEG6000處理時，轉基因株系與對照葉片的MDA含量就出現了顯著差異。不同濃度PEG6000處理，轉基因株系的MDA含量都沒有超過對照;20%濃度處理時，受體對照植株揚麥158的MDA含量已經是未脅迫處理的2.8倍，而轉基因株系B64和B608的MDA含量是未脅迫處理的1.8倍，表明轉基因株系的膜脂受損程度比對照小，也從側面說明轉基因植株的耐旱能力優于受體對照。

表4 轉基因小麥株系和受體對照葉片丙二醛含量比較Table 4 Comparison of MDA content in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.6 模擬干旱脅迫對葉片POD活性的影響

正常情況下，植物細胞內自由基的產生與清除處于一種動態平衡，一旦這種平衡遭到破壞，自由基便產生積累，POD是植物體內擔負清除H2O2的主要酶類之一，它能催化H2O2氧化其他底物后產生H2O。由表5可知，在不同濃度PEG6000脅迫下，轉基因株系B64和B208和對照揚麥158葉片的POD活性呈現先下降再升高的趨勢，不同處理轉基因株系與對照的POD活性差異沒有達到顯著水平。

表5 轉基因小麥株系和受體對照葉片POD活性比較Table 5 Comparison of POD activity in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

3 討論

MYB蛋白是植物的重要調控因子，部分MYB基因參與植物的抗旱調節。例如厚葉旋蒴苣苔中的BcMYB1可通過不依賴ABA的途徑參與調控基因表達，從而對干旱產生應答，該基因同時也能對PEG、高鹽、低溫等脅迫產生一定程度的應答［21］。擬南芥的AtMYB2基因在干旱脅迫下，可作為ABA誘導的轉錄激活子發揮作用，在其他一些逆境誘導下AtMYB2表達增強的同時，干旱應答基因rd22和AtADH1的表達也得到加強［22］。AtMYB60參與植物的耐旱脅迫過程也被證實［23］。TaPIMP1基因是根據擬南芥AtMYB108小麥同源EST序列克隆而來，研究發現擬南芥AtMYB108除了可抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和黑斑病菌(Alternaria brassicicola)等病原真菌的生長，還受高鹽、干旱、氧脅迫及外源ABA誘導［24］。本研究結果表明，TaPIMP1基因也參與了小麥對干旱脅迫的應答，TaPIMP1基因過表達的轉基因株系在模擬干旱條件下，其種子的萌發、幼苗的生長以及成株期葉片的相對含水量、可溶性糖含量、MDA含量等指標均優于受體對照揚麥158，表明TaPIMP1基因的組成型表達提高了轉基因株系的抗旱性。

中國水資源短缺，人均水資源只有世界平均的1/4。農業用水占中國用水總量的70%，但農業灌溉水平均利用率低，不及發達國家的一半。在中國北方，小麥用水已占農業用水的70%，因此，節水已成為中國北方小麥生產的重要研究課題［25］。小麥生產中除了采取節水栽培和管理措施外，耐旱小麥品種的培育和應用非常關鍵。優良小麥品種的培育需要特異種質材料的支撐，除了加強從小麥及其近緣的種質材料中篩選優異抗旱節水種質材料外，拓寬與抗旱節水相關優異基因的發掘范圍也非常重要，轉基因技術是實現這一目標的重要手段之一。高世慶等［26］將大豆GmDREB基因導入魯麥22號中，轉基因小麥能在10%PEG6000模擬干旱培養基上正常發芽生長;在18%PEG6000溶液處理后，轉基因小麥的發芽率比對照明顯提高。將大腸桿菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的融合基因TPSP導入小麥，發現轉基因小麥的海藻糖含量大幅提高;20%PEG6000溶液處理后，轉基因株系的脯氨酸含量較對照明顯提高，轉基因植株表現出較強的抗旱能力［27-28］。將棉花GhDREB導入魯麥23中也發現轉基因株系比對照具有更強的抗旱節水性能［29］。轉TaEBP基因小麥株系的抗旱節水性能也明顯高于受體對照寧春9號［30］。我們將由玉米ubiquitin組成型啟動子驅動的小麥MYB蛋白基因TaPIMP1導入揚麥158，也發現轉基因株系的耐旱能力較受體對照有所提高。這些研究表明，轉基因方法可以作為常規育種方法的補充和延伸，該方法能打破物種間的界限，將其他物種的有利基因引入到小麥中，提高小麥的耐旱性。

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