老年男性心功能不全患者外周血CD4+和CD8+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的變化及免疫調(diào)節(jié)的干預(yù)作用

韓麗娜，林曉明，臧傳波，李靖，楊立明，丁國雷，彭錦

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院保健科，海南三亞572014；2.中國人民解放軍第187中心醫(yī)院心內(nèi)科，海南海口571159）

老年男性心功能不全患者外周血CD4+和CD8+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的變化及免疫調(diào)節(jié)的干預(yù)作用

韓麗娜1，林曉明2，臧傳波1，李靖1，楊立明1，丁國雷1，彭錦2

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院海南分院保健科，海南三亞572014；2.中國人民解放軍第187中心醫(yī)院心內(nèi)科，海南海口571159）

目的探討T淋巴細(xì)胞亞群CD4+調(diào)節(jié)細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）和CD8+調(diào)節(jié)細(xì)胞（CD8+CD28-Treg）在老年男性慢性心功能不全患者外周血中的變化，以及免疫調(diào)節(jié)治療對其的影響。方法155例老年男性，114例診斷為慢性心功能不全（CCI），41例為心功能正常者。所有患者均行超聲心動圖檢測，并采集外周血。分離外周血T淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)測定CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg亞群分布。非均相免疫法檢測血漿N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）水平，免疫比濁法檢測C反應(yīng)蛋白（CRP）。參與者分成三組，第一組是正常對照組(n=41)，第二組是CCI干預(yù)組(n=60)，接受常規(guī)抗心功能不全和胸腺五肽治療(20 mg，肌肉注射，隔日1次，共3個月)，第三組是CCI對照組（n=54），只給予常規(guī)抗心功能不全治療。結(jié)果與對照組相比，CCI兩組左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg亞群水平下降；而左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、NT-proBNP和CRP水平升高。NT-proBNP和CRP水平同LVEF呈負(fù)相關(guān)，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平同LVEF呈正相關(guān)。而CCI干預(yù)組較CCI對照組能更好地升高CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-reg亞群水平而改善心功能。結(jié)論CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平變化提示其在CCI過程中發(fā)揮重要作用，CD4+和CD8+調(diào)節(jié)T細(xì)胞變化可能是治療CCI的重要方向之一。

慢性心功能不全；免疫；老年；CD4+CD25+Treg；CD8+CD28-Treg

世界老年人口迅速增多，慢性心功能不全在老年人群多發(fā)，已經(jīng)成為老年人死亡的主要原因之一。慢性心功能不全(Chronic cardiac insufficiency，CCI)作為一種綜合征，具有慢性炎癥及免疫性疾病的某些特征[1]，自身免疫參與CCI病情發(fā)展[2-3]，現(xiàn)公認(rèn)CD4+T細(xì)胞的活化在心力衰竭心臟局部的炎癥發(fā)展和全身的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用[4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Tregs)是在免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用，Tregs的激活可以抑制CD4+T細(xì)胞的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫殺傷的功能。有報道在CCI中存在Th17/Tregs比例升高[5]，但CD8+CD28-Tregs在CCI中的意義卻未見報道。本研究收集CCI病例，并給予抗心功能不全和免疫調(diào)節(jié)治療，觀察CD4+CD25+Tregs和CD8+CD28-Tregs調(diào)節(jié)細(xì)胞在CCI中的變化以及免疫調(diào)節(jié)治療的影響，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2008年1月至2012年12月來自解放軍總醫(yī)院老年心內(nèi)科和中國人民解放軍第187醫(yī)院的155例患者，其中CCI患者114例和心功能正常者41例。CCI患者根據(jù)病史、體格檢查、胸部X-線片、心電圖和N-末端前腦利鈉肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)診斷。入選CCI患者在6個月前有收縮期和舒張期功能異常，美國紐約心臟分級(New York HeartAssociation，NYHA)心功能分級法為Ⅰ～Ⅳ級。所有患者使用藥物治療至少30 d，包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體抑制劑(ARBs)、β受體阻滯劑。排除標(biāo)準(zhǔn)包括急性、慢性炎癥，或其他自身免疫性疾病、3個月內(nèi)發(fā)生不穩(wěn)定心絞痛和急性心肌梗死、3個月內(nèi)風(fēng)濕性疾病活動病灶、糖尿病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)或其他內(nèi)分泌疾病(近期使用過免疫調(diào)節(jié)劑)、嚴(yán)重肝、腎功能不全和腫瘤。最后，155例老年男性患者入選，年齡57～95歲，平均81.3歲，114例CCI患者，年齡59～95歲，平均81.6歲，41例心功能正常，年齡56～94歲，平均79.5歲。原發(fā)性疾病是冠心病96例，心律失常87例，高血壓58例，慢性風(fēng)濕性心臟病2例，擴(kuò)張型心肌病5例，老年性退行性瓣膜病8例，其中99例合并多種疾病。

1.2 分組根據(jù)NYHA心功能分級方法患者分3組，所有患者心功能級別由同一名醫(yī)師確定。將155例患者分成三組，第一組是正常對照組，心功能正常，41例；第二組是CCI干預(yù)組(心功能Ⅰ/Ⅱ級，體力活動輕、中度受限)，60例，給予慢性心功能不全常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予胸腺五肽(Thymopentin，TP5) (20 mg，肌肉注射，隔日一次，共3個月)治療；第三組是CCI對照組(心功能Ⅲ/Ⅳ級，體力活動高度受限)，54例，只給予慢性心功能不全常規(guī)治療。在治療前、后進(jìn)行超聲心動圖、BNP、CRP和CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg檢測。

1.3 超聲心動圖檢測所有患者均在我院超聲科使用美國GE公司VV7彩色多普勒超聲儀進(jìn)行超聲心動圖檢測，關(guān)于心功能測量數(shù)據(jù)有室間隔厚度、左室后壁厚度、左室收縮末期容積、左室舒張末期容積、左室收縮末期內(nèi)徑，左室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)和左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。在本研究中，我們選擇LVEDD和LVEF作為衡量心功能的客觀指標(biāo)。

1.4 標(biāo)本采集和BNP測量患者在治療前、后及安靜情況下抽取2 ml靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝試管保存，分離血漿，使用全自動生化儀非均相免疫法檢測BNP水平，免疫比濁法檢測CRP。PC5-標(biāo)記抗-CD4+單克隆抗體、PE-標(biāo)記抗-CD25單克隆抗體、FITC-標(biāo)記抗-CD8單克隆抗體、PE-標(biāo)記抗-CD28單克隆抗體和OptiLyse?C溶解液購自美國Beckman-Coulter公司。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析患者在治療前、后及安靜狀態(tài)下取肘靜脈1 ml外周血，收集到EDTA抗凝試管中。分析外周血CD4+CD25+分布，100 μl抗凝外周血加入藻紅蛋白-菁藍(lán)色素?zé)晒馑?PE-Cy5，PC5)標(biāo)記抗-CD4單克隆抗體、藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記抗-CD25單克隆抗體避光共同避光孵育20 min。為分析外周血CD8+和CD28-分布，100 μl抗凝外周血加入FITC-標(biāo)記抗CD8單克隆抗體，PE-標(biāo)記抗-CD28單克隆抗體共同避光孵育20 min。每種抗體的量是5 μl，在上機(jī)檢測之前使用OptiLyse?C溶解液溶解紅細(xì)胞，流式細(xì)胞儀為美國Beckman-Coulter公司FACScan流式細(xì)胞儀。每次至少10 000個淋巴細(xì)胞被標(biāo)記的單克隆抗體染色。陽性細(xì)胞采用CXP軟件包計算，用百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果CCI兩組病例中，年齡、心功能級別、原發(fā)病構(gòu)成比均衡，心功能明顯差于正常對照組。與正常對照組比較，CCI兩組LVEF和6MWT水平降低，LVEDD、NT-proBNP和CRP水平升高(P＜0.01)，CCI兩組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。患者基線情況見表1。

2.2 CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同心功能組的分布與正常對照組比較，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在CCI兩組降低(P＜0.01)，CCI兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2和圖1、圖2。

表1 患者基本情況

表1 患者基本情況

注：LVEF(左室射血分?jǐn)?shù))；LVEDD(左室舒張末期內(nèi)徑)；6MWT(6 min步行試驗)；NT-proBNP(N-末端前腦利鈉肽)；CRP(C反應(yīng)蛋白)。與正常對照組比較，aP＜0.01。t值(1)：CCI干預(yù)組vs正常對照組；t值(2)：CCI對照組vs正常對照組；t值(3)：CCI干預(yù)組vs CCI對照組。

項目年齡(歲) NYHA(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ，例)冠心病(例)心律失常(例)高血壓(例) LVEF(%) LVEDD(mm) 6MWT(m) NT-proBNP(pg/ml) CRP(mg/dl) CCI干預(yù)組(n=60) 82±9 21/22/17 44 45 29 39.1±3.4a58±5a287±13a863±102a5.34±0.57aCCI對照組(n=54) 81±10 19/19/16 39 40 23 38.3±3.3a59±4a286±14a878±109a5.52±0.63a正常對照組(n=41) 79±10 0/0/0 13 t值(1)t值(2)t值(3) 26 60.9±4.2 46±3 413±15 56±11 0.27±0.08 28.75 13.76 44.95 50.42 56.77 33.89 17.39 42.42 47.99 50.20 1.29 1.57 0.40 1.01 1.63

表2 治療前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布(%)

表2 治療前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布(%)

注：與正常對照組比較，aP＜0.01。t值(1)：CCI干預(yù)組vs正常對照組；t值(2)：CCI對照組vs正常對照組；t值(3)：CCI干預(yù)組vs CCI對照組。

60 54 41 CCI干預(yù)組CCI對照組正常對照組t值(1) t值(2) t值(3) 6.8±1.8a6.7±1.4a16.2±3.3 18.4 19.0 0.3 11.9±2.5a11.2±2.1a35.8±5.3 30.4 31.1 1.63

2.2 CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同心功能組的分布與正常對照組比較，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在CCI兩組降低(P＜0.01)，CCI兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2和圖1、圖2。

2.3 NT-proBNP、CRP、CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg與LVEF的相關(guān)性NT-proBNP、CRP和LVEF呈負(fù)相關(guān)(NT-proBNP：r=-0.71，CRP：r=-0.72，P＜0.01)，CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平和LVEF呈正相關(guān)(CD4+CD25+Treg：r=0.67，CD8+CD28-Treg：r= 0.73)，見圖3。

2.4 免疫調(diào)節(jié)治療對心功能的影響免疫調(diào)節(jié)治療可以降低LVEDD、NT-proBNP、CRP，提高LVEF、6MWT水平。但CCI干預(yù)組LVEDD、NT-proBNP、CRP水平較CCI對照組水平更低，LVEF、6MWT水平較CCI對照組水平更高，見表3。

表3 免疫調(diào)節(jié)治療對心功能的影響

2.5 免疫調(diào)節(jié)治療對CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布的影響和正常對照組比較，CCI患者CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平降低。與CCI對照組比較，CCI干預(yù)組能更好升高CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg水平，見表4和圖4、圖5。

表4 免疫調(diào)節(jié)治療對CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布影響(%)

圖1 治療前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布

圖2 治療前CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg在不同老年CCI患者中的分布

圖3 NT-proBNP、CRP、CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg與LVEF的相關(guān)性

圖4 免疫調(diào)節(jié)治療對CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布的影響

圖5 免疫調(diào)節(jié)治療對CD4+CD25+Treg和CD8+CD28-Treg分布的影響

3 討論

心力衰竭是各種心臟病的嚴(yán)重階段，免疫參與心力衰竭的病理生理過程。慢性心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是各種心臟病的嚴(yán)重階段，其發(fā)病率高且隨年齡增長而顯著增加，五年存活率與腫瘤相仿[6-7]。近期統(tǒng)計結(jié)果顯示，我國成年人中約有400萬心力衰竭患者。引起CHF原因依次是冠心病、高血壓性心臟病、風(fēng)心病、擴(kuò)張型心肌病(DCM)及老年性退行性瓣膜病。冠心病、高血壓、糖尿病等多種疾病同時存在對心功能的影響呈累加效應(yīng)[8-9]。

臨床觀察及實驗研究結(jié)果顯示，心衰是由于初始心肌損傷(心肌梗死、血流動力學(xué)負(fù)荷過重、炎癥)，引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，導(dǎo)致心室泵血功能低下，引發(fā)針對心臟組織自身抗體的形成。另一方面，CHF在心肌損傷與重構(gòu)的過程中，正常隱蔽的心肌組織成分可以被釋放或暴露，受到自身免疫攻擊，進(jìn)一步引發(fā)有關(guān)自身抗體的生成[10]。因而，放射性核素I111標(biāo)記抗心肌肌凝蛋白單克隆抗體單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描用于診斷和預(yù)后心肌炎、擴(kuò)張性心肌病和心梗等心臟疾病[11]。研究表明，CHF患者血清中可存在多種心臟器官特異性的自身抗體，如抗心肌肌凝蛋白、心肌肌鈣蛋白和G蛋白耦聯(lián)受體等自身抗體上。

目前研究認(rèn)為心肌炎癥、心室重構(gòu)和心力衰竭中CD4+亞群Th1/Th2比例、Th17/Treg比例發(fā)生變化[12,5]，其中Th1和Th17介導(dǎo)細(xì)胞免疫和免疫反應(yīng)，加速病情發(fā)展；而Th2類細(xì)胞因子對CHF有保護(hù)性作用；外周血中Thl和Th2細(xì)胞因子水平變化對判斷預(yù)后有較好的預(yù)測價值[13-14]。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)CHF常規(guī)治療聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療，通過降低Th1表面轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞表達(dá)T-box(T-bet)mRNA表達(dá)，提高Th2轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3(GATA-3)mRNA表達(dá)，較單純心力衰竭常規(guī)治療更能降低Th1/Th2，提高心臟射血分?jǐn)?shù)[15]。

我科主要收治老年男性患者，為本研究提供了病例來源，我們根據(jù)心功能將患者分為三組。在客觀檢查確定CCI后，我們選擇LVEF、LVEDD、NT-proBNP、CRP作為衡量CCI心功能指標(biāo)，并分析它們和LVEF之間的關(guān)系。結(jié)果同目前普遍觀點一致[16-19]。

CD4+CD25+能抑制性調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化與增殖，達(dá)到免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。近年研究表明，缺乏CD28表達(dá)的CD8+CD28-細(xì)胞同CD4+CD25+Tregs一樣，具有免疫抑制活性，也是Tregs中的一個重要群體。CD8+CD28-在自身免疫病、老年人、腫瘤患者、慢性病毒、異體移植體內(nèi)中存在并發(fā)揮重要作用，既能抑制T細(xì)胞增殖又能抑制其毒性[20-25]。CD8+CD28-Treg是由CD8+T細(xì)胞受抗原慢性刺激分化而來的終末型細(xì)胞，在炎癥組織和/或在淋巴結(jié)中非定型CD8+CD28-T細(xì)胞才是調(diào)節(jié)性細(xì)胞的來源。

抗心功能不全治療可以通過升高CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs細(xì)胞數(shù)量而改善心功能，常規(guī)抗心功能不全治療結(jié)合免疫調(diào)節(jié)治療能更好的升高CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs而改善心功能。因此我們推測CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs導(dǎo)致CCI患者免疫抑制功能低下，對炎癥反應(yīng)和免疫激活抑制功能減低而促進(jìn)了CCI疾病病程發(fā)展；免疫調(diào)節(jié)治療可以通過升高CD4+CD25+和CD8+CD28-Tregs比例而改善心功能。

（志謝：衷心感謝腫瘤大樓細(xì)胞實驗室吳亮亮協(xié)助行外周血流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞群分布。）

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Analysis of change in percentage of CD4+and CD8+Treg in peripheral blood in aged male patients with chronic cardiac insufficiency.

HAN Li-na1,LIN Xiao-ming2,ZANG Chuan-bo2,LI Jing1,YANG Li-ming1,DING Guo-lei1, PENG Jin2.1.Department of Health Care,Hainan Branch Chinese PLA General Hospital,Sanya 572014,Hainan, CHINA;2.Department of Cardiology,the 187thCentral Hospital of Chinese PLA,Haikou 571159,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the change in percentage of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg in peripheral blood in aged male patients with chronic cardiac insufficiency(CCI).MethodsThe participants were 155 elderly men,among whom 114 were diagnosed as CCI and 41 had normal heart function.All patients underwent echocardiography examination and had their peripheral blood collected.T lymphocytes in peripheral blood were separated and determined distribution of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg using flow cytometry.Serum N terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP)levels were detected by heterogeneous immunoassay.C reactive protein(CRP)was detected by immunoturbidimetry assay.Participants were divided into three groups:the CCI intervention group(

regular therapy and thymopendin,20 mg intramuscular injection,once every other day for 3 months,n=60),the CCI control group(received regular therapy,n=54),and the control group(n=41).ResultsIn comparison to the control group,levels of left ventricular ejection fraction(LVEF),CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg decreased in CCI intervention group and CCI control group,while levels of left ventricular end diastolic diameter(LVEDD),NT-proBNP and CRP increased.Levels of NT-proBNP and CRP were negatively correlated with LVEF,while levels of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg showed positive correlation with LVEF.LVEF could be much improved via increasing distribution of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg in CCI intervention group than in CCI control group.ConclusionThe abnormal distribution of CD4+CD25+Treg and CD8+CD28-Treg suggestes that they play an important role in the development of CCI.Modulation of these T lymphocytes subsets might be a strategy to treat CCI.

Chronic cardiac insufficiency;Immunity;Aged;CD4+CD25+Treg;CD8+CD28-Treg

R541

A

1003—6350（2013）19—2866—07

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.19.1196

2013-03-04)

中國人民解放軍總醫(yī)院臨床科研扶持基金（編號：2012FC-TSYS-2024）；2012年度海南省醫(yī)學(xué)普通科研立項課題（編號：瓊衛(wèi)2012PT-66）；海南省社會發(fā)展科技專項資金項目（編號：SF201337）

林曉明。E-mail：lxm_187@126.com；臧傳波。E-mail：txzzce@sina.cn